利用F0F1-ATPase分子馬達(dá)技術(shù)檢測志賀氏菌*

張捷，王燕飛，王璇，王小晉，顧德周，張惠媛，尚士進(jìn)，王娟，汪琦，王佩榮，陳廣全，樂加昌

1(北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京，100026)

2(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京，100123)

3(中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京，100102)

4(淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇淮安，223001)

5(中國科學(xué)院生物物理研究所，北京，100101)

利用F0F1-ATPase分子馬達(dá)技術(shù)檢測志賀氏菌*

張捷1，王燕飛2，王璇3，王小晉4，顧德周1，張惠媛1，尚士進(jìn)1，王娟1，汪琦1，王佩榮5，陳廣全1，樂加昌5

1(北京出入境檢驗(yàn)檢疫局，北京，100026)

2(中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，北京，100123)

3(中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京，100102)

4(淮安出入境檢驗(yàn)檢疫局，江蘇淮安，223001)

5(中國科學(xué)院生物物理研究所，北京，100101)

利用載色體chromatophore上的F0F1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器，建立應(yīng)用在食品檢測中快速檢測方法。首先從嗜熱菌中提取載色體，合成生物素化宋內(nèi)氏志賀氏菌IpaH探針，在載色體ATP合酶的ε亞基上連接ε亞基抗體－生物素－鏈霉親和素－生物素－IpaH探針，將待測宋內(nèi)氏志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和陰性對照分別與此生物傳感器結(jié)合，比較其催化ATP合成10 min后的ATP產(chǎn)生量，進(jìn)而對宋內(nèi)氏志賀氏菌DNA進(jìn)行檢測。ATP合成的量可以通過luciferase-luciferin檢測試劑所體現(xiàn)的熒光強(qiáng)度大小標(biāo)定。結(jié)果表明，chroIpaH(連接在載色體chro上的IpaH探針)的濃度在0.031 mg/mL，宋內(nèi)氏志賀氏菌DNA濃度在50 ng/mL為最適檢測條件。通過與實(shí)際檢測樣品的傳統(tǒng)檢測方法及PCR檢測方法對照，具有良好的檢測符合性。

F0F1-ATPase分子馬達(dá)，宋內(nèi)氏志賀氏菌，IpaH探針，快速檢測

近年來世界范圍內(nèi)食品安全惡性事件屢有發(fā)生，動物源性食品食源性致病菌發(fā)生率高居不下，對這些致病菌的快速檢測一直是國內(nèi)外關(guān)注的焦點(diǎn)。志賀氏菌(Shigella spp.)通稱痢疾桿菌，是一類具有高度傳染性的腸道致病菌。志賀氏菌主要通過消化道途徑傳播，侵襲腸上皮細(xì)胞，引起以發(fā)熱、腹痛、腹瀉為特征的典型的痢疾癥狀，嚴(yán)重危害人類健康［1］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年有1.647億人感染痢疾，1.1萬人死亡，其中多數(shù)為5歲以下的兒童［2］。在成年患者中，10～100CFU志賀氏菌就可通過感染腸道致病，引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)［3］。我國食品安全法規(guī)定宋內(nèi)氏志賀氏菌在食品中不能檢出。目前，包括我國在內(nèi)的許多國家對宋內(nèi)氏志賀氏菌的檢測普遍采取傳統(tǒng)檢測方法，報告檢測結(jié)果大致需要4～5d，加之檢測方法繁瑣，費(fèi)時費(fèi)力，不僅成為檢驗(yàn)部門的一項(xiàng)沉重負(fù)擔(dān)，而且也不能滿足日益發(fā)展的國際貿(mào)易的需要［4］。本研究采用高靈敏生物傳感器F0F1-ATPase分子馬達(dá)技術(shù)對動物源性食品中的宋內(nèi)氏志賀氏菌進(jìn)行檢測，大大縮短了檢測時間。F0F1-ATPase是一種旋轉(zhuǎn)分子馬達(dá)，它既能利用跨膜H+梯度合成ATP，又能水解ATP而反向運(yùn)轉(zhuǎn)H+。F0F1-ATPase普遍存在于動物線粒體的內(nèi)膜、植物葉綠體的類囊體膜和細(xì)菌的質(zhì)膜上，其主要功能是在生物體系中參與氧化磷酸化或光合磷酸化，催化合成ATP。［5］本研究所用到的載色體即存在于嗜熱菌中的質(zhì)膜。在ATP合成過程中，質(zhì)子能夠從色素體膜內(nèi)泵到膜外側(cè)，導(dǎo)致內(nèi)膜微環(huán)境溶液H+濃度變化。研究發(fā)現(xiàn)，在F0F1-ATPase上連接負(fù)載會不同程度影響其旋轉(zhuǎn)性能，在其ε亞基上連接上特異性探針能引起ATP合成速率的改變［6，7］。而且luciferase-luciferin發(fā)光強(qiáng)度與ATP濃度呈線性關(guān)系?；谏鲜鰞蓚€理論，本研究在ATP酶上負(fù)載目標(biāo)檢測物(DNA)，以luciferase-luciferin檢測試劑的熒光強(qiáng)度作為信號反應(yīng)負(fù)載程度，以達(dá)到檢測目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

宋內(nèi)氏志賀氏菌51334，鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、副溶血性弧菌 ATCC 17802、霍亂弧菌 ATCC 14035、大腸桿菌 ATCC 25922、阪崎腸桿菌 ATCC 29544，上述標(biāo)準(zhǔn)菌株購自美國典型菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

志賀氏菌增肉湯-新生霉素緩沖蛋白胨水、麥康凱(MAC)瓊脂、木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽(XLD)瓊脂，北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;PBS緩沖液(實(shí)驗(yàn)室自制)、合成緩沖液(實(shí)驗(yàn)室自制)、生物素(Biotin-AC5-Sulfo-Osu)為日本Dojindo公司產(chǎn)品;鏈球菌抗生物蛋白(Streptavidin)，sigma公司產(chǎn)品;熒光素酶(Promega)、超純水(實(shí)驗(yàn)室自制)、DNA提取試劑盒(離心柱型)DP320，天根公司;其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器與設(shè)備

恒溫培養(yǎng)箱、超速冷凍離心機(jī)，HITACHI公司，CP100MX;恒溫?fù)u床，江蘇太倉實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備廠;F4500熒光光譜儀，日立;超純水儀，Thermo;化學(xué)發(fā)光檢測儀，Promega;高壓滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的培養(yǎng)及DNA的提取

宋內(nèi)氏志賀氏菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌、霍亂弧菌、阪崎腸桿菌的標(biāo)準(zhǔn)菌株均按照國家食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行增菌及選擇性培養(yǎng)，最后獲得的菌體用于DNA的提取。食品中宋內(nèi)氏志賀氏菌的檢測方法按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.5－2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗(yàn)志賀氏菌檢驗(yàn)》進(jìn)行檢測，從陽性樣品中得到的菌株按上述方法進(jìn)行富集培養(yǎng)，獲得菌體用于DNA的提取。

將培養(yǎng)獲得宋內(nèi)氏志賀氏菌用DNA提取試劑盒(離心柱型)DP320進(jìn)行提取，詳細(xì)操作步驟見試劑盒說明書。獲得的菌體的DNA提取液用作PCR擴(kuò)增時的模板以及分子馬達(dá)傳感器的目標(biāo)檢測物。該DNA提取液置于冰箱中－20℃保存，使用時置于室溫自然解凍，然后用振蕩器振蕩混勻。

1.2.2 載色體的制備

將嗜熱菌菌種按比例1∶100接種到液體培養(yǎng)基，60 ℃ 150 r/min，培養(yǎng) 24 h。然后 4 000 r/min，30 min，4℃離心收集菌體。用提取緩沖液(20 mmol/L Tris-Cl pH8.0，100 mmol/L NaCl，2 mmol/L MgCl2，1 mmol/L DTT)重懸菌體，離心去上清液(6 000 r/min，10 min，4℃)。加入提取緩沖液重懸菌體(約1 g加入10 mL緩沖液)，再加入終濃度1 mmol/L PMSF，冰上超聲破碎30 min(超聲5 s，停8 s)。將破碎菌體離心(6 000 r/min，30 min，4℃)，去沉淀取上清液。將上清超速離心(40 000 r/min，1 h，4 ℃)，取沉淀即為載色體。最后用提取緩沖液重懸沉淀并加入終濃度50%的甘油－80℃保存。

1.2.3 探針的合成及F0F1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器的構(gòu)建

通過文獻(xiàn)及標(biāo)準(zhǔn)的查找，確定將宋內(nèi)氏志賀氏菌特異性基因IpaH作為目的基因片段，選取IpaH基因上游5’保守序列ATTCCGTGAACAGGTCGCTGCATGGCTC合成核酸探針，其中5’用生物素進(jìn)行標(biāo)記，此探針由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。另外合成5’-TCCGATACCGTCTCTGCACGCAAT-3’ 和 5’-AGCGAAAGACTGTCGAAGCTC-3’用于PCR驗(yàn)證。

取出200 μL載色體于1.5 mL EP管中，再向管中加入40 μL N-生物素標(biāo)記 ε亞基抗體，用 PBS補(bǔ)加至1 mL，37℃反應(yīng)1 h;用 PBS補(bǔ)加至1.4 mL，4℃ 30 000 r/min超速離心10 min;棄上清液，將沉淀用500 μL PBS重懸;加入鏈球菌抗生物蛋白(2 mg/mL)2 μL，用 PBS補(bǔ)加至1 mL，室溫?fù)u床上(轉(zhuǎn)速50～100 r/min)反應(yīng)10 min;用 PBS補(bǔ)加至1.4 mL，4℃ 30 000 r/min超速離心10 min，棄上清液，將沉淀用500 μL PBS重懸加入N-生物素標(biāo)記的核酸探針(10 μmol/L)50 μL，用 PBS 補(bǔ)加至1 mL，室溫?fù)u床上(轉(zhuǎn)速50～100 r/min)反應(yīng)10 min;每管用PBS補(bǔ)加至1.4 mL，4℃ 30000 r/min超速離心10 min，棄上清液，沉淀即為chroIpaH，然后用150 μL含30%甘油的PBS重懸載色體，在管壁上標(biāo)明制作日期、連接體系、制作人等信息，放入－20℃冰箱備用。

圖1 分子馬達(dá)傳感器模式圖Fig.1 The model of molecular motor sensor

1.2.4 F0F1-ATPase分子馬達(dá)檢測體系的構(gòu)建

取1.5mL EP管，加入待檢測的DNA溶液10 μL。將上述EP管置于95℃水浴5 min，然后再置于50 ℃水浴 1 min。［8］取 2 μL chroIpaH，用合成緩沖液稀釋到一定的倍數(shù)。取稀釋后的chro 10 μL加入EP管。另取1個EP管加入10 μL H2O，置于95℃水浴5 min，然后轉(zhuǎn)入50℃水浴1 min，再加入10 μL合成緩沖液作為本底對照，短暫振蕩使反應(yīng)液混勻。再向2管中分別加入30μL啟動緩沖液(啟動緩沖液由ADP(1.3 mol/L)和合成緩沖液按體積比1∶3配制，每次實(shí)驗(yàn)按需要取一定的量配制，現(xiàn)用現(xiàn)配)，振蕩使反應(yīng)液混勻，然后立即短暫離心使管壁上的液滴流下。將上述反應(yīng)體系放入37℃恒溫?fù)u床中溫育10min，啟動反應(yīng)。將EP管從搖床中取出，分別加入200 μL PBS緩沖液，振蕩使體系混勻。取一塊干凈的96孔板，將2管中的最終反應(yīng)體系加入其中，每個體系加3孔，每孔加樣50 μL，然后對每個加樣孔分別加入30 μL的熒光素酶溶液，用移液槍反復(fù)吹打幾次使溶液混勻。將96孔板上化學(xué)發(fā)光檢測儀檢測，讀取數(shù)據(jù)，對各組數(shù)據(jù)取平均值，然后用樣本數(shù)值減去本底數(shù)值即為樣本的實(shí)際熒光值。

2 結(jié)果與討論

2.1 ChroIpaH特異性實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)用ChroIpaH區(qū)分不同的菌種，以實(shí)現(xiàn)對宋內(nèi)氏志賀氏菌的檢測，不包括對宋內(nèi)氏志賀氏菌不同的亞屬的區(qū)分。用ChroIpaH檢測宋內(nèi)氏志賀氏菌、副溶血性弧菌、大腸桿菌、沙門氏菌、霍亂弧菌及阪崎腸桿菌的DNA。測得ChroIpaH的初始濃度為1.558 mg/mL，本試驗(yàn)在ChroIpaH濃度為0.031 mg/mL，DNA 濃度為50 ng/mL，37℃下啟動10 min，檢測反應(yīng)終體系的熒光值，結(jié)果見圖2。

圖2 ChroIpaH對宋內(nèi)氏志賀氏菌的特異性檢測結(jié)果Fig.2 Results of specificity of ChroIpaH on Shigellasonnei

由圖2的數(shù)據(jù)可以看出，ChroIpaH對宋內(nèi)氏志賀氏菌具有良好的特異性，能夠區(qū)分不同種屬。

2.2 F0F1-ATPase分子馬達(dá)檢測技術(shù)與傳統(tǒng)檢測方法及PCR法檢測結(jié)果對比

在與傳統(tǒng)檢測方法及PCR法檢測結(jié)果進(jìn)行對比時，進(jìn)行了ChroIpaH濃度與宋內(nèi)氏志賀氏菌DNA濃度在F0F1-ATPase分子馬達(dá)檢測的最適條件實(shí)驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果表明ChroIpaH濃度為0.031 mg/mL，宋內(nèi)氏志賀氏菌DNA濃度為50 ng/mL時最終體系的熒光值強(qiáng)度差值百分比最大，即檢測效果最佳。在利用F0F1-ATPase分子馬達(dá)檢測技術(shù)與傳統(tǒng)檢測方法及PCR法檢測結(jié)果對比時，選取ChroIpaH濃度為0.031 mg/mL下，對2株標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA濃度為50 ng/mL下進(jìn)行檢測，結(jié)果為陽性菌株。圖3顯示了通過PCR對2株標(biāo)準(zhǔn)菌株的IpaH基因進(jìn)行擴(kuò)增的電泳結(jié)果。表1顯示了F0F1-ATPase分子馬達(dá)檢測法與國標(biāo)檢測方法及PCR法檢測結(jié)果的對照，其具有良好檢出效果。

圖3 2株標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA PCR擴(kuò)增IpaH基因電泳圖Fig.3 PCR amplification of IpaH gene electrophoresis of 2 standard strains’DNA

表1 不同檢測方法結(jié)果比較Table 1 Result comparision of different detection methods

3 結(jié)論

傳統(tǒng)的宋內(nèi)氏志賀氏菌檢測方法要求對樣品進(jìn)行非選擇性增菌、選擇性增菌、分離、篩選和鑒定等步驟，一般需要4～5 d才能出具檢測報告，嚴(yán)重影響了動物源性食品的保鮮及貨架壽命及食品進(jìn)出口貿(mào)易。本研究表明，F(xiàn)0F1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感技術(shù)對宋內(nèi)氏志賀氏菌DNA的檢測最適濃度為50 ng/mL，該方法能夠滿足一般食品微生物檢測要求。利用該方法進(jìn)行食品中宋內(nèi)氏志賀氏菌檢測，由于減少了傳統(tǒng)生化鑒定檢測、PCR法等方法中的菌種富集、選擇性培養(yǎng)等步驟，而這一過程至少需要3 d，所以大大縮短了檢測時間，并最終將檢測時間控制在了2 d之內(nèi)。通過對2株標(biāo)準(zhǔn)菌株進(jìn)行傳統(tǒng)方法、PCR法及F0F1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器檢測的對比結(jié)果顯示，結(jié)果的符合性為100%。該項(xiàng)技術(shù)還為宋內(nèi)氏志賀氏菌的分子分型的研究奠定了基礎(chǔ)，為水生食品的宋內(nèi)氏志賀氏菌的溯源提供了技術(shù)支持。

由于該實(shí)驗(yàn)采用的是液相法，即參與反應(yīng)的試劑和樣品均在液相體系中進(jìn)行，所以當(dāng)樣品不純或含有雜質(zhì)時，會影響結(jié)果的判斷，因此，還可以將F0F1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器固定在膜上，以達(dá)到濾掉雜質(zhì)，減少干擾的目的［9］。

F0F1-ATPase分子馬達(dá)生物傳感器具有良好的特異性、高靈敏度以及檢測時間短等優(yōu)點(diǎn)，不僅在臨床診斷、心腦血管病的治療、工業(yè)控制、環(huán)境保護(hù)以及生物技術(shù)、生物芯片等研究領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用價值，而且對我國出入境食源性致病菌、病毒的快速、高通量檢測以及分型方面將有著更加廣泛的應(yīng)用前景。

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The study of a detecting technology for Shigellabased on F0F1-ATPase molecular motor biosensor

Zhang Jie1，Wang Yan-fei2，Wang Xuan3，Wang Xiao-jin4，Gu De-zhou1，Zhang Hui-yuan1，Shang Shi-jin1，Wang Juan1，Wang Qi1，Wang Pei-rong5，Chen Guang-quan1，Yue Jia-chang5
1(Beijing Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Beijing 100026，China)
2(Chinese Academy of inspection and quarantine，Beijing 100123，China)
3(Wangjing Hospita of China Academy of Chinese Medical Sciences，Beijing 100102，China)
4(Huai an Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Huai an 223001，China)
5(Institute of Biophysics Chinese Academy of Sciences，Beijing 100101，China)

The core technology is the use of chromatophore on the F0F1-ATPase molecular motor biosensor for rapid detection of Shigellasonnei in the food.Specific IpaHprobe were connected with F0F1-ATPase’s ε subunit using avidin-biotin system，and then biosensors were constructed，the test samples and negative sample，respectively，were combined with biosensors，to compare their catalytic ATP synthesis after 10 min.Shigellasonnei DNA in the samples could be tested.The amount of ATP synthesis could be detected by measuring the amount of H+，while the amount of H+could be indicated by fluorescence intensity through luciferase-luciferin assay.The results of our experiments showed that optimum conditions for detection were the concentration of chroIpaH was 0.031 mg/mL and the concentration of Shigellasonnei DNA was 40 ng/mL.Results from the detection of actual samples were in good agreement with those from traditional detection methods and PCR detection method.

F0F1-ATPase molecular motor，Shigellasonnei，IpaHprobe，rapid detection

博士，高級工程師(王燕飛、王璇與第一作者同等貢獻(xiàn))。

*國家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目(No.2012IK146);北京市科委階梯計(jì)劃工作項(xiàng)目資助

2013－03－04，改回日期:2013－06－07