兔出血癥病毒ZB株的分離與鑒定

楊麗梅, 馬 力,王艷萍, 沈志強(qiáng)*, 李 峰, 郭時(shí)金, 張 穎, 張志美, 徐倩倩

(1. 山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東 濱州256600；2. 山東綠都安特動(dòng)物藥業(yè)有限公司，山東 濱州256600)

兔病毒性出血癥(Rabbit hemorrhagic disease，RHD)是由兔病毒性出血癥病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV)引起的一種烈性、急性、毀滅性、高度接觸性傳染病[1-2]，該病于1984年在我國(guó)江蘇地區(qū)爆發(fā)[3]，現(xiàn)已呈全球性流行[4-6]，該病以呼吸系統(tǒng)和肝臟、脾臟、腎臟、心臟等實(shí)質(zhì)臟器淤血、出血和腫大為主要病變特征，以傳播快速、高發(fā)病率和高死亡率為主要流行特征[1,3,6]，給全球養(yǎng)兔業(yè)造成了極大危害，帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織將該病列為B類動(dòng)物傳染病，我國(guó)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局也將其列為二類動(dòng)物疫病[7]。RHDV屬于杯狀病毒科(Caliciviridae)兔病毒屬(Lagovirus)，為正鏈、單股RNA病毒，編碼VP10和VP60 2個(gè)蛋白，其中VP60為病毒的結(jié)構(gòu)蛋白、免疫原性蛋白、具有高度保守性，是RHD新型疫苗、診斷制品、分子流行病學(xué)調(diào)查的首選基因[8-10]。Alda等[11]將VP60基因進(jìn)行了克隆和系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析，指出不同地區(qū)RHDV的分子特征與進(jìn)化史，豐富了RHDV分子流行病學(xué)調(diào)查資料。管夕柱等[12]對(duì)青島即墨地區(qū)的分離病毒株VP60結(jié)構(gòu)蛋白的全基因序列進(jìn)行了qPCR 擴(kuò)增、測(cè)序和比對(duì)分析，指出該毒株VP60基因長(zhǎng)度與其他已知毒株一致，與已發(fā)表RHDV毒株的VP60基因的同源性均在90%以上，在系統(tǒng)進(jìn)化上與俄羅斯2009年的一個(gè)流行毒株同源性最高達(dá)98.1%。本研究成功分離鑒定了一株RHDV ZB株，豐富了我國(guó)RHDV地方毒株資源，為我國(guó)RHDV的分子流行病學(xué)調(diào)查與相關(guān)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、血清與試驗(yàn)動(dòng)物

克隆菌株DH5α感受態(tài)細(xì)胞由山東省濱州獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備并保存；兔病毒性出血癥陽(yáng)性血清由山東綠都生物科技有限公司提供；未免疫過(guò)兔病毒性出血癥病毒任何疫苗的健康易感兔購(gòu)自濱州市華龍養(yǎng)兔場(chǎng)。

1.2 主要試劑

0.22 μm微孔濾膜購(gòu)自上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠；RNA抽提試劑盒購(gòu)自研域(上海)化學(xué)試劑有限公司；One step RT-PCR kit(一步法反轉(zhuǎn)錄PCR試劑盒)購(gòu)自上海索萊寶生物科技有限公司；pMD18-T克隆載體購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 臨床診斷與病料的采集

調(diào)查發(fā)病兔場(chǎng)的流行病學(xué)，觀察發(fā)病兔的臨床癥狀，解剖并觀察病死兔的病理變化。采集病死兔肝臟、脾臟等具有典型病例變化的病變組織，放入自封袋內(nèi)，低溫運(yùn)輸。

1.4 病毒的分離

將采集的病料組織與滅菌生理鹽水(質(zhì)量體積比約為1∶4)于滅菌研缽充分研磨，反復(fù)凍融三次后，于4 ℃ 10 000 r/min 離心10 min，將上清液用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取濾液經(jīng)頸部皮下注射2月齡健康易感兔4只，每只2 mL，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組4只兔，注射滅菌生理鹽水作為對(duì)照，隔離飼養(yǎng)，觀察7 d。觀察病死兔的癥狀和病理變化，無(wú)菌取死亡兔的肝臟組織按上述1.3的方法處理后，盲傳3代。

1.5 純凈性檢測(cè)

按《中華人民共和國(guó)獸藥典》[13]附錄中的檢驗(yàn)方法進(jìn)行細(xì)菌、霉菌、支原體的檢測(cè)。

1.6 血凝效價(jià)測(cè)定

取第3代分離病毒，按常規(guī)方法測(cè)定其對(duì)人“O”型紅細(xì)胞的凝集效價(jià)。

1.7 致病性試驗(yàn)

將第3代分離病毒作104倍稀釋接種2月齡健康易感兔4只，每只1 mL，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組4只兔，注射滅菌生理鹽水作為對(duì)照，隔離飼養(yǎng)，觀察7 d。觀察試驗(yàn)兔的癥狀和病理變化。

1.8 特異性試驗(yàn)

將第3代分離病毒用滅菌生理鹽水稀釋為4個(gè)血凝單位的病毒懸液，與等量的抗兔病毒性出血癥病毒特異性血清混勻后，37 ℃作用30 min進(jìn)行中和。中和完畢后，測(cè)定其對(duì)人“O”型紅細(xì)胞的凝集性，同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組和陰性對(duì)照組。

1.9 免疫原性試驗(yàn)

將第3代分離病毒經(jīng)甲醛滅活后，注射2月齡健康易感兔4只，每只1 mL，同時(shí)設(shè)立對(duì)照組4只兔。14 d后，二組兔同時(shí)注射10倍稀釋的第3代分離病毒，觀察7 d，記錄試驗(yàn)兔的癥狀和病理變化。

1.10 qPCR與序列鑒定

1.10.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)文獻(xiàn)[14]的方法，在VP60基因外部設(shè)計(jì)RHDV VP60的1對(duì)特異性引物：上游引物F：5'-AGTTACGATGCTGCTAGAAAG-3'，下游引物R：5'-GCAAGTCCCAA TCCGATGAAT-3'，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.10.2 RNA提取 取第3代分離病毒200 μL，按RNA抽提試劑盒使用說(shuō)明提取病毒基因組RNA。

1.10.3 VP60基因qPCR擴(kuò)增 以提取的第3代分離病毒基因組RNA為模板，參照文獻(xiàn)[14]中的方法進(jìn)行qPCR擴(kuò)增反應(yīng)。取5 μL qPCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.10.4 分離病毒VP60基因的克隆與序列測(cè)定 將大小正確的VP60基因RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用膠回收試劑盒純化回收后，連接至pMD18-T克隆載體，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒DNA，用EcoR I/Hind III雙酶切鑒定，鑒定正確的陽(yáng)性質(zhì)粒命名為pMD-VP60，將其送測(cè)序公司進(jìn)行序列測(cè)定。

2 結(jié) 果

2.1 臨床診斷結(jié)果

該發(fā)病兔場(chǎng)臨床表現(xiàn)為成年兔首先發(fā)病，發(fā)病率在90 %左右。病兔主要表現(xiàn)為食欲急劇下降，同時(shí)精神沉郁，體溫急劇升高(均在41 ℃以上)；兔發(fā)病后3 d開(kāi)始出現(xiàn)死亡，病兔死亡前癱軟、不能站立，但高聲尖叫、掙扎、撞擊籠架，部分病兔鼻孔岀血，死后呈角弓反張。病兔剖檢后可見(jiàn)各臟器都有不同程度的淤血、出血和充血，其中肝臟最為明顯，且肝臟異常腫大；喉頭、氣管粘膜淤血或彌漫性出血，以氣管環(huán)最為明顯，整個(gè)氣管粘膜呈彌漫性暗紅色。根據(jù)以上主要癥狀初步診斷為由兔病毒性出血癥病毒感染所致，無(wú)菌采集病死兔肝臟、脾臟等具有典型病例變化的病變組織。

2.2 病毒分離

接種病料組織的4只健康家兔均在48～96 h內(nèi)發(fā)病且死亡，發(fā)病兔體溫高達(dá)41 ℃，精神委頓，表現(xiàn)出尖叫、掙扎等神經(jīng)癥狀。病死兔剖檢發(fā)現(xiàn)死兔腎臟、脾臟、肝臟、等全身實(shí)質(zhì)器官淤血、出血、充血，氣管岀血。對(duì)照組4只兔沒(méi)有表現(xiàn)任何癥狀和不良反應(yīng)，全部健康。無(wú)菌條件下，采集病死兔肝臟，將其命名為ZB株，繼續(xù)傳3代后，-20 ℃保存。

2.3 病毒純凈性的檢測(cè)結(jié)果

按現(xiàn)行獸藥典的檢驗(yàn)方法對(duì)分離病毒進(jìn)行了細(xì)菌、霉菌、支原體的檢測(cè)，結(jié)果分離病毒無(wú)細(xì)菌、霉菌、支原體生長(zhǎng)。

2.4 病毒血凝效價(jià)的測(cè)定結(jié)果

按常規(guī)的血凝試驗(yàn)方法測(cè)定ZB株第3代病毒對(duì)人“O”型紅細(xì)泡的凝集效價(jià)為1∶1024。

2.5 致病性試驗(yàn)結(jié)果

接種104倍稀釋的ZB株第3代分離病毒的4只兔在96 h內(nèi)全部死亡，攻毒兔表現(xiàn)出典型的兔病毒性出血癥病毒臨床癥狀和病例變化。對(duì)照組4只兔沒(méi)有表現(xiàn)任何癥狀和不良反應(yīng)，全部健康。

2.6 特異性試驗(yàn)結(jié)果

除陽(yáng)性對(duì)照組能夠凝集人“O”型紅細(xì)胞外，分離病毒-陽(yáng)性血清中和組、陰性對(duì)照組均不能凝集人“O”型紅細(xì)胞，表明兔病毒性出血癥陽(yáng)性血清能夠特異性中和ZB株第3代分離病毒。

2.7 免疫原性試驗(yàn)結(jié)果

功毒后，免疫由ZB株第3代分離病毒制備的兔病毒性出血癥滅活疫苗的4只兔全部健活，對(duì)照組4只兔全死亡于兔病毒性出血癥病毒，表明兔病毒性出血癥ZB株分離病毒具有良好的免疫原性。

2.8 分離病毒qPCR擴(kuò)增結(jié)果

如圖1所示，ZB株第3代分離病毒RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在位于約1 842 bp處可見(jiàn)明顯的特異性DNA擴(kuò)增條帶，與文獻(xiàn)[14]報(bào)道完全一致。

2.9 VP60基因的克隆與測(cè)序鑒定

如圖2所示，構(gòu)建的pMD-VP60克隆質(zhì)粒經(jīng)EcoR I/Hind III雙酶切鑒定得到了約2 700 bp片段(pMD18-T載體)和1 842 bp片段(VP60基因)，擴(kuò)增片段經(jīng)測(cè)序鑒定確定為RHDV VP60基因。

圖1 RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Result of PCR amplificationM.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000; 1.第3代病毒的RT-PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物; 2.對(duì)照M.DNA Marker DL 2000; 1.Product of RT-PCR;2.Control

圖2 重組質(zhì)粒pMD-VP60酶切鑒定Fig.2 Identification of recombinant cloning vectorM.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000;1.重組質(zhì)粒pMD-VP60 EcoR I/Hind III酶切;2.對(duì)照M.DNA Marker DL 2000;1.Recombinant plasmid digestedby EcoR I/Hind III；2.Control

3 討 論

兔病毒性出血癥是目前危害養(yǎng)兔業(yè)最為嚴(yán)重的急性、烈性傳染病，發(fā)病率和死亡率都極高，兔場(chǎng)一旦有兔感染該病毒，就會(huì)在整個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)迅速暴發(fā)，給兔群帶來(lái)毀滅性的災(zāi)難，造成十分巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)養(yǎng)兔業(yè)的健康發(fā)展。因此，做好兔病毒性出血癥病毒的診斷與防治對(duì)保障養(yǎng)殖業(yè)、增加國(guó)民收人均具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。本研究對(duì)山東淄博高青地區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)出現(xiàn)的家兔急性死亡進(jìn)行了診斷，根據(jù)病兔的臨床癥狀和剖檢特征初步診斷為由兔病毒性出血癥病毒感染所致。為進(jìn)一步確診，本研究進(jìn)行了病毒分離、純凈性檢測(cè)、血凝性檢測(cè)、致病性試驗(yàn)、特異性試驗(yàn)、免疫原性試驗(yàn)以及VP60基因擴(kuò)增片段的序列鑒定。將采集的肝臟等病料組織接種健康家兔后成功分離出一株兔病毒性出血癥病毒，將其命名為ZB株，該分離株病毒不含細(xì)菌、霉菌、支原體，具有良好的純凈性；該分離株病毒對(duì)人“O”型紅細(xì)泡的血凝效價(jià)為1∶1024，具有較高的病毒含量；104倍稀釋的該分離株病毒能夠使健康易感兔在96 h內(nèi)全部死亡于兔病毒性出血癥病毒，具有高度的致病性與較高的毒力；該分離株病毒與兔病毒性出血癥病毒特異性陽(yáng)性血清中和后不能凝集人“O”型紅細(xì)胞，具有良好的特異性；免疫由該分離株病毒制備的滅活疫苗的健康兔攻毒后全部健活，表明該分離株病毒具有良好的免疫原性；RNA病毒的結(jié)構(gòu)基因受環(huán)境選擇壓力的作用最易發(fā)生變異[10]，本研究對(duì)RHDV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白(VP60基因)進(jìn)行了克隆與測(cè)序，證明分離株純凈性好、病毒含量高、毒力強(qiáng)、免疫原性好、為ZB株兔病毒性出血癥病毒，為兔病毒性出血癥優(yōu)質(zhì)疫苗的成功研發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)，同時(shí)為兔場(chǎng)的發(fā)病確定了病原，豐富了我國(guó)RHDV地方分離毒株資源，為RHDV分子流行病學(xué)調(diào)查提供了參考。

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