沙棘枝葉不同部位氨基酸含量的測定與分析

秦 莉，程文杰，潘曉亮

石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003

氨基酸是指含有氨基和羧基的一類有機(jī)化合物的通稱，它是生物功能大分子蛋白質(zhì)的基本組成單位。氨基酸不僅提供了合成蛋白質(zhì)的重要原料，還為促進(jìn)生長、進(jìn)行正常代謝維持生命活動提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、飼料、化妝品和保健品等領(lǐng)域[1-2]。據(jù)統(tǒng)計，2006年全球的氨基酸原料生產(chǎn)已經(jīng)達(dá)到280萬t，其中用于醫(yī)藥、保健及化妝品等領(lǐng)域的有40萬t，約占14.5%；用于飼料添加劑約60萬t，占21.5%；用于調(diào)味劑及食品添加劑約180萬t，占64%[3]。隨著新疆自治區(qū)以防風(fēng)固沙為主的退耕還林、還草工程的實(shí)施，沙棘將在這項偉大工程中發(fā)揮巨大作用，種植面積將逐年增加，因此沙棘枝葉的生物量也隨之增加。張敏[5]、何軼等[6]分別對沙棘原汁進(jìn)行了營養(yǎng)成分分析，表明沙棘果汁中營養(yǎng)成分豐富，具有很高的開發(fā)利用價值。沙棘果實(shí)也成為我國古代藏醫(yī)、蒙醫(yī)常用的藥材，具有祛痰利肺、養(yǎng)胃健脾、活血散瘀的藥理功效，1977年衛(wèi)生部首次將沙棘列入《中華人民共和國藥典》[4]。目前，人們已經(jīng)從蠶、黑胸大蠊、羊、葫蘆巴種子、食用菌、玉米粒等不同動植物體體中分離出多種氨基酸，并對其含量進(jìn)行了分析[7-12]。但在沙棘枝葉中，氨基酸的含量相關(guān)研究還尚未報道。本文通過測定分析沙棘枝葉不同部位氨基酸的含量，為飼料領(lǐng)域的研究奠定基礎(chǔ)，同時為其他各領(lǐng)域更好地開發(fā)利用沙棘枝葉提供科學(xué)依據(jù)，使沙棘枝葉資源變廢為寶。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)原料 小果沙棘、雄性沙棘2個品種的沙棘葉、小枝(0

1.1.2 主要儀器及試劑 Sykam S-433D氨基酸分析儀，包括：電子制冷溶液存放單元S7130、自動進(jìn)樣器S5200、四元梯度泵S2100、反應(yīng)單元S4300、檢測系統(tǒng)、系統(tǒng)控制和數(shù)據(jù)處理軟件；萬分之一電子天平；樣品篩；真空泵；恒溫箱；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。

17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液、鹽酸、液氮、茚三酮、檸檬酸鈉、檸檬酸、氫氧化鈉、甲醚、硫二甘醇、乙二胺四乙酸、苯酚、鹽酸、硼酸等試劑為分析純試劑，實(shí)驗(yàn)用水均為一級水。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用酸水解法測定沙棘枝葉中氨基酸的含量。其原理是使飼料蛋白在110 ℃，6mol/L鹽酸作用下水解成單一氨基酸，再經(jīng)離子交換色譜法分離并以茚三酮做柱后衍生測定。水解中，色氨酸全部破壞，不能測量。胱氨酸和蛋氨酸部分氧化，不能測準(zhǔn)[13]。

1.2.1 混合氨基酸標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備 吸取一定量的氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液于50 mL容量瓶中，用檸檬酸鈉緩沖液定容，混勻，使各氨基酸組分濃度c(氨基酸)=100 nmol/mL。

1.2.2 樣品液的制備 處理方法同GBT18246-2000[13]。稱取含1.0～1.2 g樣品(準(zhǔn)確至0.1 mg)于20 mL安培管中；加入15 mL 6 mol/L HCL；用液氮冷凍；待液體超過三分之一凝固后，抽真空，熔化安培管使其密封；將其放在110℃的爐子上，水解24小時；水解完成后，冷卻，開管，水解液無損轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中、一級水定容，混勻；過濾；用槍取0.5 mL濾液于青霉素小瓶60 ℃，抽真空，蒸發(fā)至干；加入1～3 mL pH 2.2稀釋樣品液，使氨基酸濃度達(dá)到50-250 nmol/mL震蕩混勻，用0.22 μm 濾膜過濾后裝入氨基酸小瓶，供上機(jī)測定使用。

1.2.3 樣品的分析 儀器運(yùn)行條件： Sykam S2100壓力39.0 bar；總流速0.45 mL/min；S4300反應(yīng)器流速0.25 mL/min；柱溫60℃；檢測波長：440 nm/570 nm雙波長同時檢測，壓力6.0 bar，反應(yīng)器溫度130 ℃；分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液及試樣液20 μL進(jìn)樣。根據(jù)保留時間及標(biāo)準(zhǔn)加入法測定性，試樣峰面積與標(biāo)準(zhǔn)峰面積比較定量[14]。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 采用EXCEL表數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品及小果沙棘、雄性沙棘各不同部位氨基酸的色譜分離

經(jīng)衍生和梯度洗脫之后，在45 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了17種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸衍生物的完全分離，同時對樣品液進(jìn)行了衍生和分離，結(jié)果見附錄圖1和圖2。從圖中可看出，標(biāo)準(zhǔn)氨基酸及樣品各部位中均含有17種氨基酸，且各氨基酸之間分離良好。

2.2 小果沙棘及雄性沙棘枝葉不同部位氨基酸含量的分析

由表1和表2可知：小果沙棘、雄性沙棘氨基酸含量比較豐富，不同部位之間的氨基酸含量差異比較明顯，而且不同氨基酸之間含量差異較大，小果沙棘葉總氨基酸含量為159.61 mg/g，枝葉混合為92.27 mg/g，而雄性沙棘葉為117.48 mg/g，枝葉混合為91.00 mg/g，相比之下分別多了42.13 mg/g，1.27 mg/g，而小枝、中枝、大桿氨基酸含量則少了30.12 mg/g，8.50 mg/g，6.18 mg/g；兩個品種的氨基酸含量均以葉片最高，其次是枝葉混合，大桿中氨基酸的含量最低。小果沙棘不同部位均以天冬氨酸含量最高，比例范圍為14.90%～30.57%，其次為谷氨酸，比例范圍為9.48%～11.65%；而雄性沙棘不同部位均以天冬氨酸含量最高，比例范圍為16.64%～24.51%，葉和枝葉以谷氨酸含量較高，小枝、中枝、大桿其次以脯氨酸含量較高，比例范圍分別為10.36%～10.46%，9.79%～10.45%。

表1 小果沙棘枝葉不同部位氨基酸組成及含量

注：1.葉;2.枝葉混合;3.大桿; 4.中枝;5.小枝;a.必需氨基酸;b.半必需氨基酸;c.藥用氨基酸;d.酸性氨基酸;e.堿性氨基酸;f.中性氨基酸;S.Sample;C.Content;P.Percentage。下同。

Note:1.leaves;2.the mixture of leaves and branches;3.big branch;4.middle branch;5.small branch;a.essential amino acids;b.semi-essential amino acids;c.medical amino acids;d.acidic amino acids;e.basic amino acids;f.neutral amino acids;S.Sample;C.Content;P.Percentage.

表2 雄性沙棘枝葉不同部位氨基酸組成及含量

2.3 小果沙棘、雄性沙棘不同部位不同種類氨基酸含量分布

由表1和表2可知，兩個品種的沙棘均含有7種人體必需氨基酸、2種半必需氨基酸、9種藥性氨基酸、8種非必需氨基酸、2種酸性氨基酸、3種堿性氨基酸及12種中性氨基酸。其在總氨基酸中的比例，結(jié)果見表3。

由表3可知：同一品種不同部位氨基酸含量不同，品種間相比較其大小依次為：葉>枝葉混合>小枝>中枝>大桿。按凈含量而言：小果沙棘葉、枝葉混合中所含必需氨基酸分別為60.80 mg/g，34.14 mg/g，而雄性沙棘葉、枝葉混合中必需氨基酸分別為43.86 mg/g，32.57 mg/g。各品種中必需氨基酸均以甲硫氨酸含量最低，枝葉混合及葉以亮氨酸含量最高，小枝、中枝、大桿以賴氨酸含量最高。按比例而言：小果沙棘不同部位必需氨基酸含量在29.46%～38.09%，半必需氨基酸在7.47%～8.84%，非必需氨基酸在53.07%～63.07%，藥用氨基酸在61.11%～64.46%，酸性氨基酸在26.44%～40.06%，堿性氨基酸在4.19%～16.64%，中性氨基酸在45.74%～56.81%，必需氨基酸、半必需氨基酸、藥用氨基酸、堿性氨基酸及中性氨基酸均以葉片含量最高，枝葉混合次之。雄性沙棘必需氨基酸含量在32.08%～37.33%，半必需氨基酸在7.24%～8.89%，非必需氨基酸在53.78%～60.68%，藥用氨基酸在57.17%～63.08%，酸性氨基酸在27.09%～34.14%，堿性氨基酸在13.94%～16.68%，中性氨基酸在51.92%～56.23%，必需氨基酸及藥用氨基酸均以葉片含量最高，枝葉混合次之。

3 討 論

小果沙棘、雄性沙棘兩個品種不同部位均含有17種氨基酸，其中包括2種酸性氨基酸、3種堿性氨基酸、12種中性氨基酸。所含氨基酸種類中，天冬氨酸含量最高，谷氨酸次之，而半胱氨酸、甲硫氨酸含量最低。未檢測到色氨酸，原因是在進(jìn)行水解時色氨酸被破壞，所測半胱氨酸、甲硫氨酸含量最低，有可能發(fā)生氧化而導(dǎo)致其測含量較低。

表3 小果沙棘及雄性沙棘不同部位不同種類氨基酸在氨基酸總含量中的比例Table 3 The proportion of different type of amino acids in total amino acid from different parts of the small fruithippophae rhamnoides and the infertility hippophae rhamnoides %

注：1～5為小果沙棘樣品，分別為葉、枝葉混合、大桿、中枝、小枝；6～10為雄性沙棘樣品，分別為葉、枝葉混合、大桿、中枝、小枝；括號中的數(shù)值為所占氨基酸總量的比例，括號之外的數(shù)字為所測樣品的含量(mg/g)。

Note:1～5. belongs to the small fruit hippophae rhamnoides,which are leaves, the mixture of leaves and branches, big branches, middle branches and small branches.6～10. belongs to the infertility hippophae rhamnoides,which are leaves, the mixture of leaves and branches, big branches, middle branches and small branches.The value in the parentheses is the percent of share of the total amino acids,that outside of the parentheses is the content of the sample.

小果沙棘、雄性沙棘不同部位的氨基酸含量不同，研究發(fā)現(xiàn)不同部位氨基酸的含量大小順序依次為：葉>枝葉混合>小枝>中枝>大桿，其中小果沙棘葉片含有的必需氨基酸、半必需氨基酸、藥用氨基酸、堿性氨基酸及中性氨基酸含量最高，枝葉混合次之。雄性沙棘中必需氨基酸及藥用氨基酸均以葉片含量最高，枝葉混合次之。小果沙棘不同部位均以天冬氨酸含量最高，其次為谷氨酸；而雄性沙棘不同部位均以天冬氨酸含量最高，其次葉、枝葉以谷氨酸含量較高，小枝、中枝、大桿以脯氨酸含量較高。天冬氨酸和谷氨酸為鮮味氨基酸，是食物中鮮味重要的來源之一，這兩種氨基酸占氨基酸總量的25%以上，表明沙棘枝葉作為飼料的適口性較好。必需氨基酸中以苯丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸較高，這三種必需氨基酸對組織蛋白質(zhì)合成與分解有調(diào)節(jié)作用，可以防治肝、腎功能衰竭，亮氨酸還有刺激胰島素的分泌功能[6]。

4 結(jié) 論

本研究明確了兩個品種沙棘枝葉中不同部位氨基酸的含量及種類，必需氨基酸、半必需氨基酸、藥用氨基酸種類齊全，含量豐富，確定了蛋氨酸為其限制性氨基酸的種類，天冬氨酸和谷氨酸兩種氨基酸占氨基酸總量的25%以上，表明沙棘枝葉作為飼料的適口性較好。

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