一株土壤源高產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的分離與鑒定

董鶴娟，丁 軻*，恒子鈐，賈艷艷，彭春平，羅偉光，李 旺

(1.河南省動物疫病與公共安全院士工作站，河南 洛陽 471003；2.河南科技大學(xué) 宏翔發(fā)酵飼料實驗室，河南 洛陽 471003;3.河南省高等學(xué)校環(huán)境與畜產(chǎn)品安全重點學(xué)科開放實驗室，河南 洛陽 471003)

我國是糧食大國，纖維素資源極為豐富，每年僅農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量就高達(dá)7×108t，約占世界20%[1-2]。但秸桿中纖維素較難降解，所以目前秸桿僅有極少部分用于反芻動物飼料，絕大多數(shù)都被燃燒，不僅造成了資源的浪費，而：還會帶來環(huán)境污染[3-4]。將秸桿中的纖維素降解成畜禽可利用的多糖、蛋白質(zhì)或其他營養(yǎng)成分的研究，已成為當(dāng)務(wù)之急。目前最可能利用的手段就是篩選高效纖維素酶分解菌，但秸桿纖維素的降解不是單一菌種能夠解決的，因為秸桿的降解需要β-葡聚糖酶、內(nèi)切β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等多種纖維素酶共同參與才能完成[4]。已有的研究主要集中在真菌方面，如里氏木霉、綠色木霉、白腐菌、米曲霉等[5-7]，對細(xì)菌方面研究的較少。但真菌存在活性不穩(wěn)定和生物安全隱患等問題，而芽孢桿菌具有產(chǎn)酶能力強，耐高溫、強酸，環(huán)境適應(yīng)能力強等特點，所以很適宜作為秸桿發(fā)酵用菌種。本研究擬從自然界中分離篩選高產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌，為研究秸桿的生物降解提供了基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣 品 分別取自河南省洛陽、商丘、周口、漯河等8個地市周圍的秸桿、稻草垛下層5～10 cm的土壤58份。

1.1.2 培養(yǎng)基 (1)羧甲基纖維素鈉(CMC)剛果紅分離培養(yǎng)基：牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，瓊脂粉1.5%，CMC 1%，調(diào)pH 7.0～7.2，121 ℃，高壓滅菌20 min，每100 mL培養(yǎng)基加入3 mL 0.5%剛果紅;(2) 種子培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，調(diào)pH 7.0～7.2；(3) 發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨1%，牛肉膏0.5%，氯化鈉0.5%，CMC 1%，調(diào)pH 7.0～7.2。

1.1.3 主要試劑的配制 3，5-二硝基水楊酸試劑配制：稱取200 g酒石酸鉀鈉，溶于一定量水中，加熱溶解，添加3,5-二硝基水楊酸10.0 g、氫氧化鈉10.0 g，溶解后加入苯酚2.0 g、無水亞硫酸鈉0.5 g，全部加熱溶解后，冷卻至室溫，定容至1 000 mL。用前一周配制。

1.2 方 法

1.2.1 樣品的處理 取適量的樣品于試管中，分別加入5 mL pH 3.0的滅菌生理鹽水，混勻，置80 ℃水浴20 min，再靜止放置20 min，吸取上清200 μL涂于CMC-剛果紅分離培養(yǎng)基，置37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。

1.2.2 產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選與純化 根據(jù)菌落周圍酶解圈直徑和菌落直徑比值大小，由分離培養(yǎng)基上挑選產(chǎn)纖維素酶和酶活較高的菌株連續(xù)3次劃線接種于種子培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)48 h，置4 ℃冰箱放置24 h，采用革蘭氏染色法篩選能夠產(chǎn)生芽孢的桿菌。

1.2.3 復(fù)篩 取上述篩選的菌株的新鮮菌液2 μL滴種于CMC-剛果紅培養(yǎng)基，于37 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，測量透明圈直徑(H)和菌落直徑(C)，選擇二者比值(H/C)較大的菌株進(jìn)一步進(jìn)行酶活測定。

1.2.4 纖維素酶酶活測定 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制，方法參考國標(biāo)法(GB/T 23881-2009)。取培養(yǎng)36 h的菌液，6000 r/min離心10 min，取上清1 mL，加入1 mL含1% CMC的pH 4.8醋酸-醋酸鈉緩沖液，混勻，50 ℃恒溫水浴30 min，加入2.5 mL DNS試劑，沸水浴5 min，冷卻后定容到25 mL，在520 nm下比色，測出吸光度值，查閱標(biāo)準(zhǔn)曲線后，求出溶液中的葡萄糖含量。酶活力單位規(guī)定：在pH 5.0、50 ℃條件下，以1 mL纖維素酶液在1 min內(nèi)水解羧甲基纖維素鈉生成1 μmoL葡萄糖的酶量為1個單位(U)。

1.2.5 菌種的鑒定

1.2.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定 將上述篩選的菌種在37 ℃下培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)，采用革蘭氏染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察菌體形態(tài)。

1.2.5.2 生理生化鑒定 菌株的生理生化鑒定參照《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[8]。

1.2.5.3 菌種16S rDNA分子鑒定 根據(jù)芽胞桿菌的16S rDNA序列模板設(shè)計一對引物，P1:5'-CTGCAGCTACCGGTCGCCACCATG-3'，P2:5'-GAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3'。按照基因組抽提試劑盒(北京方寶生物有限公司)抽提的芽孢桿菌基因組為模板，PCR反應(yīng)體系如下：10×PCR buffer 5 μL，dNTP(10 mM) 1 μL，

MgCl22 μL，上下游引物(10 mM)各1 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL) 1 μL，模板DNA 1 μL，超純水 36 μL。反應(yīng)參數(shù)：94℃，3 min→(94 ℃，50 s→55 ℃，45 s→72 ℃，90 s，30 循環(huán))→72 ℃，10 min→4 ℃，保存。將產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠中電泳，并送至上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。將測序結(jié)果提交到GenBank中進(jìn)行BLAST比對，選取相似性較高的序列，利用DNAstar7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的初篩結(jié)果

將樣品經(jīng)酸和熱處理后，在分離培養(yǎng)基上初步分離出具有纖維素酶酶活的菌株42株，將這些菌株純化后分別滴種在CMC-剛果紅培養(yǎng)基上，通過比較酶解圈直徑H與菌落直徑C的比值大小(見圖1)，初步篩選出產(chǎn)纖維素酶較高的的菌株10株，結(jié)果見表1。由表1可知，所篩選出菌株的酶解圈與菌落直徑比在1.33～3.71，其中B.LY02最大。

圖1 部分菌株酶活平板篩選圖Fig. 1 Strains producing cellulase by Congo red medium

2.2 菌株的復(fù)篩結(jié)果

由表2可見，B.LY02酶活最高，可達(dá)0.5351 U/mL。因此，篩選出該菌株進(jìn)行鑒定和后期研究。

2.3 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

在普通肉湯平板上37 ℃培養(yǎng)24 h后發(fā)現(xiàn)菌落呈圓形，白色，表面濕潤，有光澤，邊緣整齊，單生或呈鏈狀，兩端鈍圓，革蘭氏染色陽性，有芽孢，且呈橢圓形，近中生(圖2)。屬于典型的芽孢桿菌的特征(圖2C)。

表1 產(chǎn)纖維素酶菌株初篩結(jié)果Table 1 The screening results of cellulase-producing

注：H.酶解圈直徑;C.為菌落直徑。

Note: H.represents the diameter of hydrolysis circle;C.stands for the diameter of colonies.

表2 不同菌株纖維素酶的比活力測定結(jié)果Table 2 The results of cellulase specific activity of different strains U/mL

2.4 菌株的生理化性質(zhì)鑒定

B.LY02生理生化結(jié)果見表3。由表3可見，接觸酶陽性，可還原硫化氫、硝酸鹽，可利用多種糖產(chǎn)酸，符合芽孢桿菌的典型特征。

圖2 部分菌株顯微形態(tài)圖Fig. 2 Microscopic morphology diagram of some strains

表3 B.LY02生理生化試驗結(jié)果Table 3 Physiological and biochemical characteristics of Strain B.LY02

注：“-”代表陰性結(jié)果，“+”陽性結(jié)果。

Note:“-”represents negative result,“+”is for positive result.

2.5 菌株16S rDNA 分子鑒定結(jié)果

以菌株B.LY02基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴增后在1%的瓊脂糖凝膠上電泳，結(jié)果如圖3所示，在約1 500 bp處有一明亮的條帶，與預(yù)期大小一致。測序結(jié)果表明菌株B.LY02的16S rDNA序列長度為1 464 bp。

圖3 16S rDNA片段PCR擴增結(jié)果1.陰性對照；2，3.PCR產(chǎn)物；4.MarkerFig. 3 PCR results of 16S rDNA fragment of strain B.LY021.Nagtive control; 2，3.PCR product;4.Marker

2.6 基于16S rDNA序列及系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

將該序列提交到GenBank中進(jìn)行BLAST比對，發(fā)現(xiàn)與地衣芽孢桿菌和球形芽孢桿菌兩個種成員具有較高的相似性，利用DNAstar7.0軟件包中Meglign中的Jotun Hein Method構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖4所示，B.LY02與Bacillus licheniformis strain CICC10095(地衣芽孢桿菌)位于同一分支，同源性高達(dá)96.5%，親緣關(guān)系最近，因此，初步鑒定該菌屬于芽孢桿菌屬地衣芽孢桿菌種。

3 討 論

目前秸桿降解最有效的途徑應(yīng)該還是生物降解[5-7]，而細(xì)菌，尤其是芽孢桿菌，是動物飼料中應(yīng)用最為廣泛的一種益生菌，具有多種益生功能[9-10]。一般來說芽孢桿菌是細(xì)菌中產(chǎn)酶最多的菌種，而且酶活也較高[11-12]。本研究從自然界土壤中分離到了一株高產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌，其新鮮培養(yǎng)液中酶的比活力最高可達(dá)0.5351 U/mL。嚴(yán)文岱等[1]分離的6株菌的纖維素酶比活力最高為0.2137 U/mL，郭成栓等[13]報道的短小芽孢桿菌的纖維素酶的比活力為1.96 U/mL。而段學(xué)輝等[15]從土壤中分離的綠色木霉CMC酶活力達(dá)146.68 U/mL，說明真菌分泌纖維素酶的能力強于細(xì)菌，所以可以根據(jù)實際需要，選擇不同的菌株進(jìn)行纖維素的降解。本研究將對該菌株進(jìn)行誘變和產(chǎn)酶條件優(yōu)化，進(jìn)一步提高該菌株產(chǎn)纖維素酶的能力，我們將在以后的試驗中驗證其降解功效。

圖4 菌株B.LY02基于16S rDNA序列系統(tǒng)進(jìn)化樹分析Fig. 4 The phylogenetic tree based on 16S rDNA gene sequence of strain B.LY02

近年來關(guān)于產(chǎn)纖維素酶菌株分離的報道比較多[17-19]，但大多研究一般都是采用CMC作為底物，然后將樣品稀釋液涂布在分離培養(yǎng)基上，再采用剛果紅染色挑出產(chǎn)酶菌，這種方法要先影印出分離培養(yǎng)基上的菌落，程序繁瑣，工作量較大，且很難篩選到最優(yōu)菌株[20-22]。而用剛果紅染色的目的就是區(qū)分菌落周圍是否含有纖維素，與剛果紅和纖維素結(jié)合的時間沒有關(guān)系，兩者的結(jié)合是一種可逆反應(yīng)。依據(jù)這個原理，本研究直接將過濾除菌的剛果紅溶液在倒平板前加入到培養(yǎng)基中，使其終濃度為1.5%左右(濃度控制在1.5%～2.0%最佳)，當(dāng)培養(yǎng)基中的CMC被細(xì)菌降解時，剛果紅-纖維素復(fù)合物就會解離，從而在菌落周圍顯示出透明圈，可以更直觀、快捷、準(zhǔn)確地進(jìn)行產(chǎn)纖維素酶菌株的篩選。從該試驗的結(jié)果也可以看出，酶活測定的結(jié)果與透明圈和菌落直徑的比值呈一定的相關(guān)性，所以采用這種方法有利于篩選到高纖維素酶活的菌株。另外，試驗在對樣品初處理時采用了80 ℃高溫和pH 3.0處理，這對于有針對性地分離耐高溫和耐酸菌株的分離是很有效的，尤其是芽孢桿菌的分離，因為絕大多數(shù)細(xì)菌很難在80 ℃和pH 3.0條件下存活20 min，試驗結(jié)果也表明初分離的菌株絕大多數(shù)都是能夠產(chǎn)芽孢的菌株，說明這是一種排除其它雜菌分離特定菌株的最有效的方法之一。

4 結(jié) 論

本研究從土壤中分離獲得了一株高產(chǎn)纖維素酶的芽孢桿菌，經(jīng)鑒定為地衣芽孢桿菌，而且該菌株具有耐熱和耐酸的性能。建立了一個簡便的產(chǎn)纖維素酶菌株的分離方法，為進(jìn)一步從自然界中分離其它種類的產(chǎn)纖維素酶菌株提供了技術(shù)支持，為豐富益生菌菌種庫奠定了基礎(chǔ)。

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