不同濃度玻璃化冷凍液對牛未成熟卵母細胞發(fā)育能力的影響

栗穎華 ， 禹學禮 ，張德勛 ，陳君怡，許亞坤，李曉霞，昝林森

(1.河南科技大學 動物科技學院，河南 洛陽 471003；2.洛陽巨爾乳業(yè)有限公司，河南 洛陽471031；3.西北農(nóng)林科技大學 動物科技學院，陜西 楊凌 712100)

GV期卵母細胞冷凍具有重要的科學意義和應用價值。在人類醫(yī)學領(lǐng)域，GV期卵母細胞冷凍保存可以為放療癌癥患者、卵巢摘除患者保存生殖能力；在畜牧領(lǐng)域，未經(jīng)成熟培養(yǎng)的GV期卵母細胞現(xiàn)場冷凍可以避免長時間運輸對卵母細胞造成的不良影響，為胚胎生物技術(shù)研究提供充足的試驗材料。目前，卵母細胞的冷凍效率非常低，且大多以MII期卵母細胞為冷凍對象，牛MII期卵母細胞經(jīng)冷凍后再體外受精，囊胚率11%～25%[1]；而GV期卵母細胞對冷凍更敏感，一直被視為生物材料的“冷凍禁區(qū)”，直到近些年采用玻璃化冷凍才獲得成功，冷凍后成熟率僅為19%～21%，囊胚率僅為1%～5%[2]。影響牛GV期卵母細胞玻璃化冷凍效果的因素眾多，玻璃化冷凍液是最重要的影響因素之一。玻璃化冷凍液的特點是必須添加高濃度冷凍保護劑，冷凍中雖然高濃度冷凍保護劑可以降低冰晶的形成，從而減少冰晶對細胞的損傷[3]，但是也會因滲透壓的變化[4]及冷凍保護劑的化學毒性[5-6]而對細胞造成損傷。因此，不同冷凍保護劑對細胞毒性、不同冷凍保護劑的配比是牛GV期卵母細胞冷凍的研究熱點之一。

本文擬在相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，探索不同玻璃化冷凍液對牛卵丘卵母細胞復合體(cumulus oocyte complexes , COCs)冷凍后體外成熟及受精后發(fā)育能力的影響，從而檢測常用的幾種玻璃化冷凍液對卵母細胞的毒性，并篩選出最佳的牛GV期卵母細胞玻璃化冷凍液。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 卵母細胞 從宰殺后的牛體內(nèi)取出卵巢，置于30 ℃的PBS中運到實驗室；從直徑2～8 mm的卵泡中抽吸COCs，在體視顯微鏡下揀出，根據(jù)試驗設(shè)計隨機分組。精液為洛陽白馬寺種公牛站生產(chǎn)的細管冷凍精液。

1.1.2 開放式拉長細管(open pulled straw, OPS)制備 在小酒精燈火焰上方加熱0.25 mL細管(IMV，L'Aigle，F(xiàn)rance)，細管變軟后拉伸至內(nèi)徑約0.8 mm，消毒備用。

1.1.3 主要試劑和溶液配制 除特別說明外均購自Sigma公司(St. Louis，MO，USA)。玻璃化冷凍液(vitrification solution, VS)的基礎(chǔ)液均為mPBS+0.5M蔗糖+18%聚蔗糖+0.4%BSA。

玻璃化冷凍液1(VS1)：平衡液為基礎(chǔ)液添加5%EG、5%DMSO；冷凍液為基礎(chǔ)液添加10%EG、10%DMSO。

玻璃化冷凍液2(VS2)：平衡液為基礎(chǔ)液添加10%EG、10%DMSO；冷凍液為基礎(chǔ)液添加20% EG、20%DMSO。

玻璃化冷凍液3(VS3)：平衡液為基礎(chǔ)液添加10%EG、10%DMSO；冷凍液為基礎(chǔ)液添加25%EG、25%DMSO。

解凍液：基礎(chǔ)液為TCM-199 +10%FCS+25mM Hepes，解凍液為基礎(chǔ)液中分別加入0.1 M、0.25 M和0.5 M蔗糖而成。

1.2 方 法

1.2.1 三種玻璃化冷凍液對牛卵母細胞的毒性試驗 在20 ℃的室溫條件下，隨機將采集的COCs分成數(shù)量相近的7份，將其中一份直接進行體外成熟培養(yǎng)，作為對照組；將另6份分別在不同濃度的平衡液中平衡10 min后，在相應的玻璃化冷凍液(VS1、VS2、VS3)中暴露30 s或60 s，最后脫除冷凍劑，分別進行體外成熟培養(yǎng)。將卵母細胞進行染色并觀察，第一極體排出、細胞核達到MII期者為成熟卵母細胞，統(tǒng)計成熟率。

1.2.2 三種玻璃化冷凍液對牛卵母細胞體外受精(In Vitro Fertilization,IVF)后發(fā)育能力的影響 將每次采集的COCs隨機分成數(shù)量相近的4份，其中1份直接進行體外成熟(In Vitro Maturation,IVM)、IVF和早期胚胎體外培養(yǎng)(In Vitro Calture,IVC)，作為對照組；另3份分別在VS1、VS2、VS3中冷凍，冷凍采用OPS法[7]，解凍后再進行IVM、IVF和IVC[8]，受精后2 d統(tǒng)計卵裂率，5～6 d統(tǒng)計桑椹胚數(shù)量并計算桑胚發(fā)育率，7～8 d統(tǒng)計囊胚數(shù)量并計算囊胚發(fā)育率。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPASS 17.0 進行方差分析，以“平均數(shù)±標準誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種玻璃化冷凍液對牛卵母細胞的毒性

表1表明，在20 ℃的室溫條件下，牛COCs在VS1中分別暴露30 s、60 s并經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后，成熟率分別為81.5%、78.9%，與對照組(81.6%)差異均不顯著(P>0.05)，但對照組、30 s組與60 s組依次呈下降趨勢。在VS2中分別暴露30 s、60 s并經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后，成熟率分別為78.5%和75.2%，與對照組差異亦均不顯著(P>0.05)，對照組、30 s組與60 s組間成熟率亦呈下降趨勢。在VS3中停留30 s時，成熟率為73.0%，與對照組差異不顯著(P>0.05)，但60 s組成熟率僅為53.2%，明顯低于對照組(P<0.01)。

表1 三種玻璃化冷凍液對牛卵母細胞的毒性Table 1 In vitro maturation rates of bovine COCs exposed to different vitrification solutions

注：同列肩標字母不同者表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Note：Values in same column with different superscripts differ significantly(P<0.01). The same below.

2.2 三種玻璃化冷凍液對IVF后發(fā)育能力的影響

表2表明，未經(jīng)冷凍的卵母細胞成熟率、卵裂率、桑椹胚率和囊胚率分別為80.7%、56.4%、20.6%和19.7%，而3個試驗組的上述各指標分別明顯低于對照組(P<0.01)。3個試驗組中，VS1、VS2和VS3組的卵母細胞成熟率分別為61.1%、67.9%±4.7和63.6%，3組間差異不顯著(P>0.05)；VS1、VS2和VS3組卵裂率分別為19.0%、33.9%和27.7%，VS2和VS3組明顯高于VS1組，但后二者間差異不顯著(P>0.05)；VS2組的桑椹胚率、囊胚率分別為6.3%和5.4%，與VS3組(5.0%、3.6%)差異不顯著(P>0.05)，VS1組桑椹胚率和囊胚率均為0。

表2 三種玻璃化冷凍液對牛卵母細胞IVF后發(fā)育能力的影響Table 2 Effect of three vitrification solutions on developmental competence of bovine oocyte following IVF

3 討 論

3.1 三種玻璃化冷凍液對牛卵母細胞的毒性

卵母細胞玻璃化冷凍的效果與玻璃化冷凍液中冷凍保護劑的濃度、作用時間等因素密切相關(guān)[9]，高濃度冷凍保護劑有可能因滲透壓及自身的化學毒性對卵母細胞產(chǎn)生一定程度的傷害[10]。在眾多研究及本實驗室前期研究的基礎(chǔ)上，本研究選擇三種不同濃度的玻璃化冷凍液進行毒性試驗。在VS1中，DMSO占10%，EG占10%，總濃度為2.89M；VS2中DMSO濃度為20%，EG濃度為20%，總濃度為5.78 M；VS3中DMSO濃度為25%，EG濃度為25%，總濃度達到7.19 M。在20℃的室溫條件下，將COCs分別置于上述幾種玻璃化冷凍液中30 s或60 s后再進行體外成熟培養(yǎng)，對比其成熟率發(fā)現(xiàn)，當卵母細胞與冷凍液的接觸時間控制在30 s以內(nèi)時，三種不同濃度的冷凍液對卵母細胞成熟率均沒有明顯影響。但是，隨著冷凍保護劑濃度的升高、卵母細胞在冷凍保護劑中停留時間的增加，毒性作用呈增加趨勢，在VS3中，DMSO和EG濃度各達25%(滲透性冷凍保護劑總濃度達50%)，當作用時間增加到60 s時，對卵母細胞呈現(xiàn)出明顯的毒性。說明冷凍保護劑的濃度越高、作用時間越長，對卵母細胞造成的損傷越大。就本試驗所選的三種玻璃化冷凍液而言，如果將其在室溫下的操作時間控制在30 s以內(nèi)，就不會影響卵母細胞成熟率。實際上，在冷凍過程中只要操作者技術(shù)熟練，并采用分批冷凍，可以將室溫下卵母細胞與玻璃化冷凍液的作用時間控制在30 s 以內(nèi)。

3.2 三種玻璃化冷凍液對牛卵母細胞IVF后發(fā)育能力的影響

目前，卵母細胞冷凍大多以MII期卵母細胞為冷凍材料，本試驗以未經(jīng)成熟培養(yǎng)的COCs為冷凍對象，此時，其中的卵母細胞大多處于GV期。將COCs分別用VS1、VS2、VS3冷凍并解凍后，經(jīng)IVM、IVF和早期胚胎體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示VS2冷凍COCs的效果最好，雖然VS3組與VS2的冷凍效果沒有明顯差異，但由于VS3的濃度高于VS2，從盡可能減小冷凍保護劑濃度對細胞的毒性考慮，GV期卵母細胞的首選冷凍液應是VS2。

本試驗中， COCs經(jīng)玻冷凍、解凍和IVM后，三個試驗組中VS2組的卵母細胞成熟率最高，為67.9%±4.7，但明顯低于對照組(80.7±5.6；P<0.05)，比試驗1中VS2 30 s組的卵母細胞成熟率(78.5%±5.1，表1)低10.6%，說明牛GV期卵母細胞冷凍后成熟率的降低主要受冷凍和解凍過程的影響，而不是由冷凍保護劑的毒性造成的。

冷凍保護劑在細胞內(nèi)外的平衡是決定細胞冷凍成功與否的關(guān)鍵，而牛COCs的物理、化學和生物學特性決定了其不利于冷凍。據(jù)Massip[11]分析，卵母細胞周圍包被數(shù)層卵丘細胞，又是比較大的單細胞，使得冷凍保護劑進入細胞的速度大大降低，從而影響了玻璃化冷凍的效率。鑒于此，在前人及本實驗室前期研究的基礎(chǔ)上，本試驗選擇了三個配方(VS1、 VS2、VS3)做進一步篩選試驗，三個配方中均采用化學毒性較小、分子量小、滲透性強的DMSO和 EG作為細胞內(nèi)抗凍劑，以降低冷凍保護劑的毒性，提高滲透速度。本試驗中，雖然VS2、VS3組分別獲得了5.4%、3.6%的囊胚率，但明顯低于對照組的19.7%，冷凍效果仍不理想，需要在理論和方法上進行更多的深入研究。

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