胎兒成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)分離方法對(duì)豬體細(xì)胞核移植胚胎發(fā)育潛力的影響

黃雅瓊，石德順，陳旭健，李家洲，曾詩媛，謝秋季，趙仕花，阮桂文

(1.玉林師范學(xué)院 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 玉林 537000 ；2.廣西大學(xué) 動(dòng)物繁殖研究所，廣西 南寧 530005)

在生產(chǎn)實(shí)踐中，由于各種因素的影響，造成體細(xì)胞核移植效率低下的問題非常嚴(yán)重，制約了該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展和應(yīng)用。供核體細(xì)胞是影響核移植效率的關(guān)鍵因素之一[1]。血清饑餓誘導(dǎo)G0期是哺乳動(dòng)物體細(xì)胞核移植克隆成功的必要步驟[2]。誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G1和G2/M等時(shí)期可得到克隆后代[3-4]。血清饑餓處理供體細(xì)胞成為眾多研究者首選的方法[5]。在各種影響因素中，體細(xì)胞和卵母細(xì)胞細(xì)胞周期協(xié)調(diào)更是體細(xì)胞核移植最為關(guān)鍵的環(huán)節(jié)[6]。目前，卵母細(xì)胞體外發(fā)育質(zhì)量及培養(yǎng)體系仍不完善，需進(jìn)一步提高核移植重構(gòu)胚的體外發(fā)育的潛能。本研究探討了胎兒成纖維細(xì)胞的不同處理方式等相關(guān)因素對(duì)核移植重構(gòu)胚胎發(fā)育能力的影響，以期提高豬體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚胎的發(fā)育潛力。

1 材料與方法

1.1 卵母細(xì)胞的成熟

卵母細(xì)胞的采集和成熟培養(yǎng)采用黃雅瓊等[7-8]介紹的方法，將屠宰場采集的青年母豬的卵巢放在38 ℃加熱板上，抽取卵巢表面卵泡內(nèi)的卵泡液和卵母細(xì)胞，在體視顯微鏡下挑選并收集具有完整卵丘細(xì)胞層和部分致密卵丘細(xì)胞的卵母細(xì)胞(卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體)。在1 mL含有促卵泡素(FSH)0.1 μg/mL的成熟培養(yǎng)液(無血清的TCM-199基礎(chǔ)液+10%PFF+0.1%mg/mL cysteine)的培養(yǎng)液中，38.5 ℃、5% CO2和100%濕度的條件下，培養(yǎng)卵母細(xì)胞22～24 h，接著在不含F(xiàn)SH的成熟培養(yǎng)液中成熟培養(yǎng)22～24 h。培養(yǎng)44～48 h后，卵母細(xì)胞復(fù)合體用100 μL的移液槍反復(fù)輕輕吹打或者放入0.1%透明質(zhì)酸酶5 min，除去顆粒細(xì)胞，然后逐一檢查第一極體(PB1)的排出情況，計(jì)算第一極體排出率，并以此計(jì)算卵母細(xì)胞的體外成熟率。

1.2 卵母細(xì)胞的激活

排出第一極體的卵母細(xì)胞首先放入5 μmol/L ionomycin(離子酶素：ION)中激活5 min，然后將清洗后的卵母細(xì)胞放入含有2 mmol/L 6-DMAP(6-二甲氨基嘌呤)中的培養(yǎng)液中培養(yǎng)3～4 h。

1.3 豬胎兒成纖維細(xì)胞的準(zhǔn)備

豬胎兒成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞，胎兒成纖維細(xì)胞的收集方法參照文獻(xiàn)[9-10]。首先用PBS溶液清洗干凈胎兒組織，剪碎成1 mm3大小的組織塊，在37 ℃、5%CO2、100%濕度條件下貼壁培養(yǎng)于10%FCS的DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)培養(yǎng)液中。當(dāng)80%以上胎兒成纖維細(xì)胞細(xì)胞匯合后，用無Ca2+，Mg2+的PBS清洗原代細(xì)胞，再用0.25%胰蛋白酶的Hank's液2～3 mL消化3～5 min使胎兒纖維細(xì)胞分離，中止消化后，將胎兒成纖維細(xì)胞離心洗滌(800×g，5 min)，加入10%FCS的DMEM培養(yǎng)液中，制成1.0×106個(gè)細(xì)胞/mL的懸浮液，即可多次進(jìn)行接種培養(yǎng)和傳代。

1.4 核移植重構(gòu)胚胎的構(gòu)建

將卵母細(xì)胞輕輕吹打或放入含0.1%透明質(zhì)酸酶的培養(yǎng)液中輕輕反復(fù)吹打，除去卵母細(xì)胞外顆粒細(xì)胞后獲得裸卵，挑選其中具有第一極體、細(xì)胞質(zhì)均勻的成熟良好的卵母細(xì)胞移入含有5 μg/mL細(xì)胞松弛素B+TCM199+5 mmol/L Hepes+5 mmol/L NaHCO3+5%OCS的培養(yǎng)液中，置于顯微操作儀的載物臺(tái)上。用盲吸法去核和Hochest33342染色法進(jìn)行染色[8-9]，確認(rèn)去核后的卵母細(xì)胞放入胚胎培養(yǎng)液(NCSU-23+0.3%BSA)中30 min促進(jìn)形態(tài)的恢復(fù)。用含有0.25%胰蛋白酶消化分離和處理胎兒成纖維細(xì)胞，將纖維細(xì)胞和恢復(fù)后的卵母細(xì)胞移入操作盤，構(gòu)建卵母細(xì)胞-胎兒成纖維細(xì)胞復(fù)合體。

1.5 核移植重構(gòu)胚胎的融合與激活和培養(yǎng)

將卵母細(xì)胞-胎兒成纖維細(xì)胞復(fù)合體放在融合液0.28 mol/L甘露醇+0.05 mmol/LCaCl2+0.1mmol/LMgSO4+5 mmol/LHepes+0.1%BSA+5mg/L酚紅溶液中，施加電流進(jìn)行融合。在38.5℃、5%CO2、100%濕度的條件下培養(yǎng)電融合后的卵母細(xì)胞-供體細(xì)胞復(fù)合體30 min～60 min，在顯微鏡下檢查融合情況，注入卵周隙的胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)入去核后的卵母細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，卵母細(xì)胞與供體細(xì)胞融合為一體即為重構(gòu)胚胎。計(jì)錄各組融合數(shù)及融合率[11]。將融合激活后的重構(gòu)胚胎用豬胚胎培養(yǎng)液NCSU-23(North Carolina State University-23，NCSU-23)溶液在38.5 ℃，含5%CO2的空氣和100%濕度的條件下培養(yǎng)48 h后觀察分裂率。每2 d將進(jìn)行重構(gòu)胚胎培半換液1次，6～9 d記錄囊胚率。重構(gòu)胚胎的融合率為融合卵數(shù)/NT卵數(shù)的比率；重構(gòu)胚胎的卵裂率為分裂卵數(shù)/培養(yǎng)卵數(shù)的比率；重構(gòu)胚胎的囊胚率為囊胚發(fā)育卵數(shù)/分裂卵數(shù)的比率。

1.6 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)一：采用血清饑餓法和接觸抑制法誘導(dǎo)第6代胎兒成纖維細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期，以70%～80%匯合的胎兒成纖維細(xì)胞作對(duì)照組，進(jìn)行70%～80%接觸、完全接觸抑制法(100%長滿)和血清饑餓法(0.5%FCS+DMEM)比較，探討三種處理胎兒成纖維細(xì)胞的方法對(duì)重構(gòu)胚胎體外發(fā)育的影響。

試驗(yàn)二：分別用常規(guī)傳代消化、4 ℃冷藏和冷凍-解凍的第6代胎兒成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞，分析核移植胚胎的發(fā)育潛力。

試驗(yàn)三：分別用酶消化法和組織塊法分離培養(yǎng)的胎兒成纖維細(xì)胞作為供體細(xì)胞構(gòu)建核移植胚胎，分析不同方法對(duì)核移植胚胎發(fā)育潛力的影響。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用INSTAT統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行卡方(x2)分析檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同傳代培養(yǎng)方法對(duì)核移植胚胎發(fā)育潛力的影響

胎兒成纖維細(xì)胞不同傳代的培養(yǎng)方法對(duì)核移植胚胎發(fā)育潛力的影響見表1。由表1知，完全接觸抑制組融合率較高，與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)，接觸抑制組分裂率與血清饑餓組分裂率相比，差異顯著(P<0.05)，但各組之間的囊胚率差異不顯著(P>0.05)。70%～80%接觸、完全接觸抑制法(100%長滿)和血清饑餓法(0.5%FCS+DMEM)是三種調(diào)節(jié)供體細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期的有效的同期化處理胎兒成纖維細(xì)胞作為供體的方法。

2.2 成纖維細(xì)胞對(duì)核移植胚胎發(fā)育潛力的影響

在常規(guī)消化(Routine Digestion)情況中，即正常傳代消化分離的胎兒成纖維細(xì)胞直接用，一部分收集于Eppendorf離心管中，放于4 ℃冷藏，液氮( 196 ℃)冷凍解凍(37 ℃)的胎兒成纖維細(xì)胞復(fù)蘇后收集做為供體細(xì)胞，構(gòu)建重構(gòu)胚胎。三種方法的結(jié)果見表2。由表2知，豬胎兒成纖維細(xì)胞冷凍解凍后的核移植分裂率和囊胚發(fā)育率均顯著低于新鮮和4 ℃冷藏的細(xì)胞(P<0.05)。雖然融合率無顯著差異(P>0.05)，但豬胎兒成纖維細(xì)胞解凍后不宜直接進(jìn)行核移植。

表1 胎兒成纖維細(xì)胞的不同傳代的培養(yǎng)方法對(duì)核移植胚胎發(fā)育潛力的影響Table 1 Effects of different passage culture methods of fetal fibroblasts on embryos developmentalcapacity of porcine somatic cells nuclear transfer

注：同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)為不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，無字母或相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)；括號(hào)內(nèi)數(shù)字分別是融合率、分裂卵率、囊胚率。下同。

Note:Values with different small letter superscripts in the same column mean significant difference(P>0.05),while those with the same letter or without superscripts mean insignifiant difference(P>0.05)；Numbers in the brackets are respectively fusion rate, cleavage rate and blastocyst rate.The same below.

表2 不同方法處理的胎兒成纖維細(xì)胞對(duì)核移植胚胎發(fā)育潛力的影響Table 2 Effects of different treatment methods of fetal fibroblasts on embryos developmental capacity of porcine somatic cells nuclear transfer

2.3 不同分離培養(yǎng)方法對(duì)核移植胚胎發(fā)育的影響

用組織塊和酶消化法分離培養(yǎng)的胎兒成纖維細(xì)胞對(duì)核移植胚胎發(fā)育潛力的影響見表3。表3表明，兩種分離方法分離得到的胎兒成纖維細(xì)胞構(gòu)建的重構(gòu)胚胎在融合率、分裂率和囊胚率方面沒有顯著差異(P>0.05)。組織塊和酶消化法分離方法均是分離培養(yǎng)的胎兒成纖維細(xì)胞細(xì)胞的方法。

表3 胎兒成纖維細(xì)胞不同分離培養(yǎng)方法對(duì)重構(gòu)胚胎發(fā)育潛力的影響Table 3 Effects of different cell dissociate culture methods of fetal fibroblasts on embryos developmental capacity of porcine somatic cells nuclear transfer

3 討 論

3.1 胎兒成纖維細(xì)胞不同傳代的培養(yǎng)方法對(duì)核移植胚胎發(fā)育潛力的影響

調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的方法有血清饑餓法、接觸抑制法、誘導(dǎo)法及輔助用化學(xué)試劑調(diào)節(jié)等方法。目前，血清饑餓法、接觸抑制法較常用，很多克隆動(dòng)物都由這兩種方法獲得[12-14]。血清饑餓法是經(jīng)典的調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的方法，首例體細(xì)胞克隆綿羊“Dolly”等多種動(dòng)物克隆成功都是采用將供體細(xì)胞調(diào)節(jié)至G0/G1期而實(shí)現(xiàn)[15-18]。Beyhan等[19]和Ono等[20]研究表明，供體細(xì)胞處于G0/G1狀態(tài)下有利于核移植重構(gòu)胚胎發(fā)育。因此，供體細(xì)胞處于G0/G1階段是體細(xì)胞核移植重構(gòu)胚胎進(jìn)行重編，啟動(dòng)發(fā)育的重要因素。通?？衫眉?xì)胞貼壁生長接觸抑制的特性將其調(diào)節(jié)到G0/G1期，體細(xì)胞在體外貼壁培養(yǎng)并接觸抑制時(shí)，70%左右的細(xì)胞處于G0/G1期的細(xì)胞生長周期內(nèi)[21-23]，100%匯合的供體細(xì)胞自然停止生長，其細(xì)胞周期達(dá)到靜止期。本試驗(yàn)結(jié)果表明，胎兒成纖維細(xì)胞在完全接觸抑制組的融合率較高，接觸抑制組分裂率顯著高于血清饑餓組，但不同處理間的囊胚率差異不顯著。血清饑餓處理的細(xì)胞DNA碎片明顯較高，影響核移植的效率[23-24]。Bochenek等[25]研究表明，血清饑餓處理并不能顯著增加成纖維細(xì)胞處于G0/G1期細(xì)胞的比率。Kues等[23]研究證實(shí)，血清饑餓培養(yǎng)時(shí)間延長會(huì)導(dǎo)致大量的DNA碎裂；降低培養(yǎng)液中血清濃度可以盡量維持細(xì)胞不分化的狀態(tài)，降低細(xì)胞的生長速度，調(diào)節(jié)細(xì)胞生長狀態(tài)，不發(fā)生增殖，從而使細(xì)胞達(dá)到周期一致。血清饑餓處理對(duì)囊胚的早期發(fā)育沒有明顯的促進(jìn)[26-29]。誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入G1和G2/M等時(shí)期可得到克隆后代[3-4]。Vignon等[30]和Cibelli 等[31]等不經(jīng)血清饑餓同樣得到了克降動(dòng)物，這說明供體細(xì)胞可以不需要血清饑餓。Kasinathan等[3]研究發(fā)現(xiàn)，分別從25%和100%匯合程度人供體細(xì)胞分離出來的G1期細(xì)胞為供體細(xì)胞，其重構(gòu)胚胎的囊胚的細(xì)胞數(shù)量和囊胚率都沒有明顯區(qū)別。這說明可能細(xì)胞的匯合程度并不能做為判斷細(xì)胞周期同期化程度的標(biāo)準(zhǔn)。多數(shù)研究者均認(rèn)為，血清饑餓和接觸抑制可以提高供體細(xì)胞處于G0/G1周期階段的數(shù)量，G0/G1周期階段的供體細(xì)胞有利于重構(gòu)胚胎的發(fā)育和克隆動(dòng)物的成功[15-19]。

Boquest等[22]認(rèn)為沒有一種最佳方法調(diào)節(jié)細(xì)胞周期完全達(dá)到(100% G0/G1)周期同步的要求，而Woods等[5]采用血清饑餓的方法處理供體細(xì)胞。本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，胎兒成纖維細(xì)胞70%～80%接觸、完全接觸抑制法(100%長滿)和血清饑餓法(0.5%FCS + DMEM)三種方法均可有效地同期化供體細(xì)胞周期。對(duì)于供體細(xì)胞周期的問題，Enright等[32]建議通過監(jiān)測(cè)細(xì)胞周期同期化建立預(yù)測(cè)克隆胚胎命運(yùn)的模型。對(duì)于供體細(xì)胞的周期同步調(diào)節(jié)問題上，細(xì)胞的處理方法、血清的成分、血清濃度、血清培養(yǎng)時(shí)間、細(xì)胞生長的最佳密度、細(xì)胞生長的合適時(shí)間、促進(jìn)細(xì)胞生長的調(diào)節(jié)因子、細(xì)胞生長的影響因素、影響細(xì)胞生長的處理和調(diào)控方法等還需要進(jìn)一步研究。

3.2 不同處理方法對(duì)核移植胚胎發(fā)育潛力的影響

使用胎兒成纖維細(xì)胞為供體，探討在常規(guī)消化法、4 ℃冷藏法和液氮( 196 ℃)冷凍與解凍(37 ℃)法處理后，對(duì)豬重構(gòu)胚胎發(fā)育潛力。常規(guī)消化法和冷藏方法可有效處理胎兒成纖維細(xì)胞。Liu等[33]成功得到了冷藏2～5 d后的牛囊胚；Guo等[34]成功得到了冷藏細(xì)胞克隆的山羊后代。據(jù)王立芳[35]報(bào)道，成功得到冷凍細(xì)胞克隆的種間水牛。張運(yùn)海[29]研究表明，冷藏的細(xì)胞支持囊胚發(fā)育效率沒有受到不利影響，也獲得首例用冷藏的豬體細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白的克隆囊胚。新鮮解凍的供體細(xì)胞步驟較復(fù)雜，可利用的傳代次數(shù)也不多，效率低，所以人們通過冷凍/解凍供體細(xì)胞的方法來保證核移植的供體細(xì)胞的需要。本試驗(yàn)中，對(duì)胎兒成纖維細(xì)胞冷凍/解凍后，發(fā)現(xiàn)冷凍效果不理想，可能是大部分細(xì)胞受到了冷凍損傷，造成重構(gòu)胚胎的卵裂率降低；豬胎兒成纖維細(xì)胞冷凍解凍后的核移植分裂率和囊胚發(fā)育率均顯著低于新鮮和4 ℃冷藏的細(xì)胞，說明豬胎兒成纖維細(xì)胞解凍后不宜直接進(jìn)行核移植。本試驗(yàn)中胎兒成纖維細(xì)胞所構(gòu)建的核移植重構(gòu)胚胎出現(xiàn)分裂到細(xì)胞的不同階段，沒有得到冷凍解凍后的胎兒成纖維細(xì)胞構(gòu)建的核移植囊胚。其原因可能是胎兒成纖維細(xì)胞在冷凍解凍過程中，胎兒成纖維細(xì)胞冷凍所形成的細(xì)胞內(nèi)的冰晶融解后，對(duì)胎兒成纖維細(xì)胞的亞顯微結(jié)構(gòu)成一定程度的損壞，胎兒成纖維細(xì)胞的由于冷凍損傷而活力下降。另外，由于使用方法不同及條件差異，造成試驗(yàn)結(jié)果不盡相同，本試驗(yàn)中，胎兒成纖維細(xì)胞冷凍解凍的重構(gòu)胚胎不能發(fā)育至囊胚階段。

3.3 不同分離培養(yǎng)方法對(duì)核移植胚胎發(fā)育潛力的影響

酶消化法和組織塊培養(yǎng)法是常規(guī)的細(xì)胞分離培養(yǎng)方法。王啟鳳等[36]利用胰蛋白酶消化供體細(xì)胞易受pH、溫度、組織的硬度以及酶的濃度、消化時(shí)間和消化液濃度等因素的影響，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，不易貼壁。因此，在使用酶消化法分離的細(xì)胞作為供體細(xì)胞時(shí)，會(huì)影響核移植胚胎的發(fā)育潛力。組織塊培養(yǎng)法獲得細(xì)胞生長狀態(tài)良好，形態(tài)規(guī)則整齊，取材方便，成本低，但原代細(xì)胞生長慢，細(xì)胞傳代時(shí)間長。研究表明，組織塊的采樣為1 cm2左右為宜，這可降低對(duì)動(dòng)物健康狀況和應(yīng)用價(jià)值的影響[37-40]。蔡文琴[41]研究發(fā)現(xiàn)，組織塊法進(jìn)行培養(yǎng)可提高培養(yǎng)成功率。本試驗(yàn)中，采用酶消化法和組織塊法分離得到的供體細(xì)胞構(gòu)建的重構(gòu)胚胎的融合率(60.15%和67.72%)、分裂率(64.34%和60.63%)和囊胚率(17.39%和14.92%)沒有顯著差異，這說明兩種胎兒成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)方法均為有效的分離培養(yǎng)方法，可支持重構(gòu)胚胎的構(gòu)建和發(fā)育。

4 結(jié) 論

結(jié)果表明，100%長滿匯合培養(yǎng)是較好的豬胎兒成纖維細(xì)胞培養(yǎng)處理方法；豬胎兒成纖維細(xì)胞解凍后不宜直接進(jìn)行核移植；組織塊法和酶消化法均可用于分離培養(yǎng)豬體細(xì)胞核移植的胎兒成纖維細(xì)胞。

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