5個豬種CAST基因第二內(nèi)含子微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多態(tài)性分析

趙先萍，張燕青，梁 琳，何永梅，高鵬飛，郭曉紅，李步高，曹果清*

(1.山西省畜牧獸醫(yī)學(xué)校，山西 太原 030024；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院，山西 太谷 030801)

鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin，CAST)為內(nèi)源性專一抑制鈣蛋白酶活性的蛋白質(zhì)，可識別鈣蛋白酶與鈣結(jié)合引起的構(gòu)象變化與特異性結(jié)合，抑制其活性降低蛋白質(zhì)水解[1]，影響肌肉嫩度。肌肉嫩度主要取決于肌纖維直徑大小、肌節(jié)長度、肌內(nèi)脂肪含量和結(jié)締組織等因素。研究表明，CAST等位基因A(Lys)和G(Arg)與肌肉的嫩度、屠宰45 min后pH值及滴水損失存在強相關(guān)[2]；CAST/Rsa I和CAST/Msp I多態(tài)位點對背膘厚、大理石紋有明顯影響[3]；CAST/Hinf I位點對肌內(nèi)脂肪含量、肉色評分、失水率和貯存損失有顯著影響[4]。CAST基因在多個性狀上影響著胴體品質(zhì)和肉質(zhì)。

對豬CAST基因分析發(fā)現(xiàn)，其第2內(nèi)含子中存在以GT為核心序列的微衛(wèi)星座位，有關(guān)該座位的遺傳變異和效應(yīng)還未見報道。本研究分析了長白豬、大白豬、杜洛克豬、馬身豬和山西黑豬的CAST基因第2內(nèi)含子微衛(wèi)星座位的遺傳多態(tài)性，為該基因應(yīng)用于改善家畜肉質(zhì)品質(zhì)等方面奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗豬群及材料

長白豬60頭、大白豬54頭、杜洛克豬35頭、馬身豬42頭、山西黑豬36頭，均來自山西省大同市種豬場。用耳號鉗剪耳組織約0.1 g，放入裝有1 mL 70%乙醇的1.5 mL離心管中，冰壺帶回實驗室，-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。研究中所用的Taq DNA Polymerase、dNTPs、50 bp DNA Ladder Marker等試劑均為寶生物工程(大連)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 豬基因組DNA的提取與檢測 采用常規(guī)的酚/氯仿抽提法提取基因組DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.2 PCR擴增 根據(jù)CAST基因第二內(nèi)含子序列，采用primer 3.0軟件在線引物，上游引物為：5'-AGGAACCCAGAAGAGGTGCT-3'；下游引物為：5'-TGTCCTTGCCCTCTAAGATGT-3'，引物由華大基因(深圳)公司合成，擴增產(chǎn)物約189 bp。 PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括：2.0 μL 10 PCR Buffer (Mg2+)、0.4 μL dNTPs (10 mmol/L)、1.0 μL Mixed Primer、0.2 μL Taq DNA polymerase (5U/μL)、2.0 μL DNA 模板、14.4 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56.6 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃保溫7 min，最終4 ℃保存。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.2.3 基因型分型 擴增良好的個體用12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳進行基因型分型，銀染顯色。用Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)的Quantity One軟件計算等位基因大小，判定個體基因型。所用的分子量標(biāo)記為寶生物工程(大連)有限公司的50 bp DNA Ladder Marker。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Popgen32和PIC軟件計算等位基因頻率、基因型頻率、有效等位基因數(shù)、遺傳純合度、遺傳雜合度和多態(tài)信息含量等指標(biāo)。

2 結(jié)果與分析

2.1 微衛(wèi)星多態(tài)性檢測及基因頻率分布

在所檢測的群體中，共檢測到4個等位基因，分別是A(171 bp)、B(179 bp)、C(185 bp)和D(191 bp)，存在10種基因型。在5個供試豬群中，在該座位上的基因頻率和基因型頻率分布見表1。由表1可知，在山西黑豬和杜洛克豬群體中，等位基因D的頻率較高，分別為0.6389和0.5143；在馬身豬群體中，等位基因B的頻率較高，為0.6310；在大白豬和長白豬群體中，4種等位基因的頻率相近，分別介于0.1389～0.3889和0.1417～0.3500。就基因型頻率分布來看，在山西黑豬群體中，檢測到6種基因型，DD型頻率最高，為0.3889；在馬身豬群體中，也檢測到6種基因型，BB型和AB型頻率較高，分別為0.3810和0.3572；在長白豬和大白豬群體中，分別檢測到9種和8種基因型；在杜洛克群體中，檢測到9種基因型，DD型和AD型頻率較高，分別為0.3143和0.2286。

表1 豬CAST基因第2內(nèi)含子微衛(wèi)星座位在不同豬種中的等位基因頻率和基因型頻率Table 1 Allele frequency and genotypic frequency of the microsatellite locus within intron 2 of CAST gene in different pig populations

2.2 5個豬種CAST基因第2內(nèi)含子微衛(wèi)星座位的遺傳特性分析

5個豬種CAST基因第2內(nèi)含子微衛(wèi)星座位有效等位基因數(shù)、遺傳純合度、遺傳雜合度、多態(tài)信息含量等指標(biāo)見表2。由表2可知，在該座位上，長白豬和大白豬的有效等位基因數(shù)較高，分別為3.6567和3.4570，而山西黑豬和馬身豬的有效等位基因數(shù)偏低，分別為2.1910和2.0888。長白豬和大白豬的遺傳純合度較高，分別為0.6667和0.7037，山西黑豬和馬身豬的遺傳雜合度較高，分別為0.6111和0.5476。在該位點上，除馬身豬為中度多態(tài)外，其余品種均呈高度多態(tài)。

3 討論與小結(jié)

鈣蛋白酶抑制蛋白(Calpastatin, CAST)是細胞內(nèi)鈣蛋白酶系統(tǒng)的內(nèi)源性抑制劑。研究表明CAST基因活性提高會增加鈣蛋白酶抑制蛋白的表達，抑制肌肉蛋白質(zhì)水解，促使蛋白質(zhì)降解減少，影響肌肉嫩度。因此，CAST基因被認(rèn)為是影響肉質(zhì)品質(zhì)的候選基因，基因內(nèi)的突變位點對肉質(zhì)品質(zhì)有顯著影響。研究表明，CAST基因cDNA序列上的A317G和G2042C突變對嫩度及背膘厚有顯著影響，而對pH值和滴水損失無顯著影響[5]；內(nèi)含子24上的A916G 和C1633G突變對肌肉嫩度、屠宰45 min后pH值及滴水損失有顯著影響(P<0.05)[6]；內(nèi)含子6上的MspⅠ多態(tài)位點對肌肉嫩度、pH 值、系水力有顯著影響(P<0.05)，HinfⅠ酶切位點對肌內(nèi)脂肪含量有顯著影響(P<0.05 )，對肌肉嫩度有極顯著影響(P<0.01)[7]。本研究小組在豬CAST基因外顯子9檢測到C193T和C256T錯義突變，C193T引起蘇氨酸向異亮氨酸的轉(zhuǎn)變，C256T引起蘇氨酸向蛋氨酸的轉(zhuǎn)變，但這兩個突變位點對山西白豬6月齡活體背膘厚無顯著影響(未發(fā)表)。雞CAST基因CDS區(qū)的G35193T突變?yōu)殄e義突變，可引起氨基酸Tyr(D)-Asp(Y) 的變異，該突變位點對雞肌纖維密度和直徑有著顯著的影響(P<0.05)，同日齡雞群AA型個體的肌纖維密度高于AB型、肌纖維直徑低于AB型，且均達到顯著水平(P<0.05)；同體重雞群BB型個體的肌纖維密度高于AB型、肌纖維直徑低于AB型，且均達到顯著水平(P<0.05)[8]。牛CAST基因內(nèi)含子6上檢測到XmnⅠ多態(tài)位點，對剪切力值有顯著影響，BB純合型與AB雜合型的效應(yīng)值明顯小于AA型，差異達到顯著水平，而對大理石紋的影響未達到顯著水平[9]；延邊黃牛CAST基因內(nèi)含子16上存在g101681A→G、g101745 A→G、g101758 T→C、g101828 T→C、g101888 T→C 及g101912 G→A 等6個突變位點，該位點基因型多態(tài)性與蒸煮損失、亞麻酸含量及肉色等多種肉質(zhì)性狀相關(guān)[10]。由此可見，CAST基因不同區(qū)域的遺傳變異都可能影響到畜禽的肉質(zhì)品質(zhì)。

表2 不同豬種CAST基因第2內(nèi)含子微衛(wèi)星座位有效等位基因數(shù)、純合度、雜合度和多態(tài)信息含量Table 2 Effective allele number (Ne), homozygosity (Ho), heterozygosity (He), and polymorphism informationcontent (PIC) for the microsatellite locus within intron 2 of CAST gene in different pig populations

在真核生物基因表達過程中，由于mRNA的剪接，內(nèi)含子在成熟的mRNA和蛋白質(zhì)中不作為編碼序列出現(xiàn)，但在基因轉(zhuǎn)錄中有重要的調(diào)控作用[11]。Joan等[12]研究發(fā)現(xiàn)IGF-I基因第1內(nèi)含子的以CA為重復(fù)序列的微衛(wèi)星座位與160日齡血清IGF-I濃度、背膘厚和瘦肉量有關(guān)，該座位與豬的平均日增重也有關(guān)聯(lián)[13]。本研究中，豬CAST基因第2內(nèi)含子存在以GT為核心序列的微衛(wèi)星座位，檢測到4個等位基因和10種基因型，在不同豬種中，優(yōu)勢等位基因不完全相同，在山西黑豬和杜洛克豬群體中，D為優(yōu)勢等位基因，頻率分別為0.6389和0.5143；在馬身豬群體中，等位基因B的頻率較高為0.6310。在不同類型豬種中，等位基因存在的方式不同，長白豬和大白豬的遺傳純合度較高，而山西黑豬和馬身豬的遺傳雜合度較高。鑒于CAST基因?qū)ωi肉質(zhì)品質(zhì)的影響及該微衛(wèi)星座位基因型分布在不同品種中的差異，我們推測該微衛(wèi)星座位可能對肉質(zhì)品質(zhì)有一定影響，但還有待于進一步研究證實。

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