MicroRNA對皮膚毛囊發(fā)育調(diào)控的研究進展

張桂山，徐 晶,姜懷志*

(1. 吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，吉林 長春 130118；2.吉林農(nóng)業(yè)大學 發(fā)展學院，吉林 長春 130600)

皮膚是保護身體內(nèi)部器官免受外界環(huán)境危害以及保持體內(nèi)水分的重要屏障。在真皮乳頭層里，毛根被內(nèi)、外毛鞘包圍，外毛鞘又被結(jié)締組織細胞包圍，形成口袋狀，稱毛囊(hair follicle)。毛囊由毛桿，毛凸，毛球，毛乳頭，毛基質(zhì)等部分組成。毛囊分為初級毛囊和次級毛囊。毛囊發(fā)育包含三個時期，分別是生長期(anagen)、退行期(catagen)及休止期(telogen)。miRNA是一類由19～25個核苷酸組成的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，通過與靶基因mRNA3’端非編碼區(qū)配對結(jié)合，并根據(jù)互補程度不同指導沉默復合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻譯。據(jù)估計有超過三分之一的編碼蛋白受到miRNA的調(diào)節(jié)。目前關于miRNA的研究主要集中于人和小鼠，而miRNA對羊等家畜皮膚毛囊發(fā)育的分子調(diào)控機制研究報道的文獻相對較少。

1 miRNA的生源說及功能

miRNA是一類含19-25 nt的RNA分子，是大量細胞進程的必需調(diào)節(jié)器。通過促進mRNA降解或抑制mRNA翻譯從而調(diào)節(jié)基因表達，對于哺乳動物主要是通過對mRNA翻譯的抑制，來調(diào)節(jié)基因的表達[1]。據(jù)估計超過三分之一的編碼蛋白mRNA受到miRNA的調(diào)節(jié)。miRNA的表達有3種不同的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)機制?；騼?nèi)位于內(nèi)含子區(qū)miRNA被轉(zhuǎn)錄前體編碼，并與編碼基因轉(zhuǎn)錄共用同一個啟動子，需要II型RNA聚合酶和剪接體元件來完成生物發(fā)生；基因間的miRNA 位于非編碼區(qū)，由未知啟動子轉(zhuǎn)錄[2]；多順反子的miRNA來源于含有多個發(fā)夾結(jié)構的原始轉(zhuǎn)錄本，不同的發(fā)夾結(jié)構生成不同的miRNA。miRNA的生源說是復雜的，在哺乳動物細胞內(nèi)，與蛋白編碼基因類似，miRNA的轉(zhuǎn)錄需要RNA 聚合酶II參與。pri-miRNA轉(zhuǎn)錄本通常由幾千個堿基對構成，在3’末端加尾，5’端加一個7-甲基鳥苷的帽子，但成熟的miRNA5’端沒有帽子結(jié)構，3’端沒有尾巴結(jié)構[3]。細胞核內(nèi)的核糖核酸酶ⅢDrosha分解pri-miRNA為幾個miRNA前體(premiRNA)，輔助因子DGCR8是Drosha活性所必需，它的兩個雙鏈RNA結(jié)合域首先與pri-miRNA相結(jié)合，Drosha與輔助因子DGCR8復合物在pri-miRNA底部ssRNA/dsRNA 結(jié)合點將pri-miRNA切割。miRNA前體大約70-90 nt，是帶有莖環(huán)發(fā)夾結(jié)構的二級結(jié)構[4-5]，miRNA前體3’端包含2 nt的突出端[6-7]。核輸出蛋白5屬于核周蛋白家族核質(zhì)轉(zhuǎn)運因子，負責運輸病毒的發(fā)夾RNA和一些tRNA。一旦miRNA前體被運輸進入細胞質(zhì)，被叫做Dicer(切酶)的核糖核酸酶Ⅲ在幾個輔助因子(TAR RNA結(jié)合蛋白，TRBP與 PACT)的作用下對miRNA前體進行加工，形成帶有2 nt突出端的21-27 nt的片段，Dicer最終將其加工成為成熟的miRNA，進而形成RNA誘導的沉默復合體(RISC)[8]。Thomas Andl[9]發(fā)現(xiàn)Dicer在miRNA調(diào)控小鼠表皮、毛囊發(fā)育及功能具有重要作用。miRNA通過和靶基因mRNA堿基互補配對引導沉默復合體(RISC)降解靶mRNA或阻礙其翻譯，根據(jù)堿基互補程度或使靶mRNA降解，或抑制其翻譯，進而調(diào)節(jié)基因表達[10]。如果miRNA與靶mRNA完全互補，沉默復合體則使靶mRNA降解，部分互補則使靶mRNA脫帽或脫腺苷化抑制其翻譯[11]。最近的研究表明miRNA參與多種調(diào)節(jié)途徑，包括發(fā)育、病毒防御、造血過程、器官形成、細胞增殖和凋亡、脂肪代謝、免疫應答等等。miRNA 生源說及轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制如圖1[11]所示：

圖1 miRNA 生源說及轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制[11]Fig.1 miRNA biogenesis and post-transcriptional gene silencing mechanism

2 miRNA在皮膚中表達的檢測技術

了解miRNA的調(diào)節(jié)功能，首先要正確認識miRNA。關于miRNA的早期研究是基于小RNA及cDNA的克隆測序技術來發(fā)現(xiàn)新的miRNA。將19-30 nt的小片段RNA 3’端和5’端結(jié)扎，形成特定的包含3’端和5’端具Dicer分裂產(chǎn)物特性的單鏈RNA，此過程需要RNA酶III的作用。對已克隆的小RNA庫進行PCR擴增測序，進而測定小RNA的序列和表達豐度，Yi等[12]將此法應用于17.5 d 胎鼠表皮與毛囊miRNA克隆測序發(fā)現(xiàn)，miR-199家族在毛囊中高表達，而在表皮中無表達；而miR-200家族則都表達，說明miRNA呈現(xiàn)組織特異性表達。此外，let-7家族、miR-21和 miR-17家族以及miRNA的一個亞型miR-203在上皮組織中表達。隨著技術的進步，微陣列(芯片)技術被用于快速檢測上皮組織中miRNA。隨著對miRNA在皮膚組織中表達的深入研究，研究者由基于微陣列技術轉(zhuǎn)向研究情境變化后miRNA在信號通路中的表達。Ryan等[9,13]對Dkk1過表達的轉(zhuǎn)基因鼠研究發(fā)現(xiàn)，miR-200b 和 miR-196a在毛囊發(fā)育過程中具有重要作用。為了闡明單個miRNA時空表達，研究人員采用原位雜交技術詳盡的闡述了miR-203在哺乳動物皮膚中的表達[14]。Yi[15]采用深度測序技術用于檢測表皮miRNA的表達。唐曉惠[16]采用高通量的深度測序技術在藏綿羊皮膚毛囊內(nèi)發(fā)現(xiàn)了86個全新的miRNA。深度測序技術發(fā)現(xiàn)或?qū)ふ倚碌膍iRNA的能力得到了極大的提高[15]。此外，實時熒光定量RT-PCR，Northern blot等方法可以用于miRNA表達量的檢測。

3 miRNA對皮膚毛囊發(fā)育的調(diào)控

大多數(shù) miRNA呈現(xiàn)出組織特異性表達以及不同發(fā)育階段特異性表達的特點，這說明miRNA可能參與了復雜的基因表達調(diào)控過程，并決定了生物發(fā)生發(fā)育功能。miRNA參與多種動物表皮形態(tài)學發(fā)生及毛囊的生長發(fā)育過程。Yi等[12]研究發(fā)現(xiàn)表皮和毛囊內(nèi)miRNA的表達是小鼠正常皮膚發(fā)育所必需。p63是復層上皮組織中維持干細胞的必需調(diào)節(jié)器，而miR-203直接抑制p63的表達，miR-203明確了基底粗細胞和分化的上基部細胞的分子調(diào)節(jié)范圍，從而確保臨近皮層的固有的功能[17]。赫曉燕[18]研究了羊駝耳部和背部皮膚組織中miRNA 差異表達，通過miRNA芯片檢測到39個miRNA在耳部和背部皮膚高表達，利用預測軟件預測發(fā)現(xiàn)let-7b 和miR-24 的靶基因中含有與毛囊生長發(fā)育和毛發(fā)品質(zhì)相關的基因，說明miRNA 可能參與羊駝皮膚和毛囊的生長發(fā)育、更新以及毛發(fā)品質(zhì)的調(diào)控。唐曉惠[16]采用Solexa高通量測序從藏綿羊皮膚毛囊中發(fā)現(xiàn)了86個全新的miRNA。三個時期毛囊特異表達miRNA的數(shù)量分別為：生長期10個，衰退期27個，休止期7個。通過實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)檢測發(fā)現(xiàn)miRNA-31在綿羊毛囊的生長發(fā)育中存在差異表達，其中在生長期高表達，而在衰退期低表達，呈逐漸下降的趨勢，同時預測了 miRNA-31的靶基因，發(fā)現(xiàn)KRT17與miRNA-31存在潛在的靶位點；此外研究還發(fā)現(xiàn)miRNA-184的表達量從毛囊生長期到衰退期呈逐步上升的趨勢，而miRNA-205則表現(xiàn)為先上升后下降，其在衰退期毛囊表達量最高。Zhang等[19]采用高通量測序技術對鴨皮膚毛囊miRNA進行了序型分析，采用生物信息學分析預測miRNA的靶基因，并發(fā)現(xiàn)miRNA在鴨皮膚功能和皮膚演化過程中具有重要作用[19]。Wnt/β-catenin、Shh-Bmp及Notch信號通路在皮膚毛囊發(fā)育過程中具有重要作用，通過生物信息學預測，miR-1623的靶基因β-catenin是Wnt/β-catenin通路中的關鍵分子，這也說明了miR-1623在皮膚毛囊發(fā)育過程中的重要調(diào)控作用。miR-107和 miR-10a表達上調(diào)，而miR-17-3p，miR-31，miR-451，miR-2188，miR-1623表達下調(diào)。Mardaryev[20]研究發(fā)現(xiàn)小鼠毛囊miR-31表達量從退行期到休止期顯著增加，將反義miR-31抑制因子注入小鼠皮膚內(nèi)，結(jié)果加速了毛囊生長期發(fā)育，改變了毛基質(zhì)角質(zhì)細胞的分化和毛干的形成。微陣列、qRT-PCR 和 Western blot分析miR-31負調(diào)節(jié)Fgf，Dlx3轉(zhuǎn)錄因子及Wnt/Bmp信號通路元件等的表達，熒光指針測定miR-31的靶基因包括Krt16， Krt17， Dlx3及Fgf10，說明miR-31通過調(diào)節(jié)毛囊中靶基因的表達，從而保證毛囊發(fā)育及毛纖維的生成[20]。Corey[21]研究發(fā)現(xiàn)miR181a在培養(yǎng)的雛雞耳蝸基底乳頭中過表達，并促進新毛細胞增殖，通過anti-miR181a轉(zhuǎn)染，進一步驗證miR181a在雛雞內(nèi)耳毛細胞再生中的重要作用，發(fā)現(xiàn)anti-miR181a顯著鈍化細胞再生應答，這就說明了miR181a促細胞增殖的作用。

4 展 望

羊毛的品質(zhì)與產(chǎn)量是影響羊毛生產(chǎn)的最重要經(jīng)濟因素。毛囊數(shù)量及毛囊的形態(tài)決定著毛(絨)產(chǎn)量及品質(zhì)。毛囊發(fā)生及毛(絨)生長周期分子調(diào)控機制具有一定的保守性，但不同物種和不同品種動物的毛囊具有物種和品種特異性，小鼠和人的毛囊研究結(jié)果并不能完全適用于羊等其它動物。由于miRNA廣泛參與組織細胞等發(fā)生發(fā)育調(diào)控，miRNA給我們提供了一個新的研究羊皮膚毛囊發(fā)育調(diào)控思路。通過miRNA表達及靶基因、靶蛋白的預測，進而應用轉(zhuǎn)錄組學、蛋白質(zhì)組學等方法揭示羊皮膚毛囊發(fā)育及生長周期的分子調(diào)控機制，篩選出控制毛(絨)生長性狀及品質(zhì)性狀的重要基因及其它調(diào)控因子，進一步采用活體試驗與離體試驗驗證相關調(diào)控因子的功能，從而明確皮膚毛囊發(fā)育的分子調(diào)控機制，為羊育種提供理論依據(jù)。

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