福建黃兔卵泡抑制素βA亞基cDNA的克隆與序列分析

桑 雷，孫世坤，陳冬金，陳巖峰，謝喜平

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，福建 福州 350013)

抑制素( Inhibin, INH) 是睪丸支持細(xì)胞和卵巢顆粒細(xì)胞分泌的一類糖蛋白激素, 由α和β兩個亞基通過二硫鍵連接而成的二聚體[1]，其α亞基上有糖基化位點(diǎn)，β亞基有A、B 兩種類型, 故INH存在2種形式，即INHA(αβA)和INHB(αβB)[2]。二硫鍵是INH行使抑制垂體FSH分泌功能所必須的主鍵，分離的α和β亞基均無生物學(xué)活性[3]。INH對動物生殖機(jī)能具有重要調(diào)節(jié)作用，INH對雌性動物最基本的生物學(xué)作用是抑制FSH的合成和分泌, 調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育和成熟。INH對雌性動物卵泡發(fā)育的作用隨著卵泡的逐漸成熟而增強(qiáng), 這種作用具有劑量依賴關(guān)系[4]。通過抑制素抗原免疫可以促進(jìn)動物卵泡發(fā)育，有效地提高雌性動物的排卵率，提高家畜的繁殖力。在雄性動物中，INH主要與公畜的精液品質(zhì)和雄性不育顯著相關(guān)，抑制素免疫能有效提高雄性動物的繁殖性能[5]。在生產(chǎn)上，INH是確定單胎和多胎動物種屬特異性排卵數(shù)最重要的激素之一[6-7]。因此，INH的α和β亞基可作為研究家畜繁殖性狀的候選基因。

福建黃兔是我國地方優(yōu)良肉兔品種，具有適應(yīng)性廣、抗病力強(qiáng)、胴體品質(zhì)好、繁殖率高等諸多優(yōu)點(diǎn)[8]。本試驗以福建黃兔為對象，克隆了卵泡抑制素βA亞基基因(INHBA)，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為下一步研究福建黃兔的高繁特性提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 材 料

總RNA提取試劑盒、膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒購自O(shè)mega公司；pMD18-T載體、AMV反轉(zhuǎn)錄酶、DNA Maker和dNTPs(2.5mmoloL-1)均購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR Master Mix(2×)購自fermentas；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA的提取與cDNA制備 從福建省連江玉華山生態(tài)農(nóng)場購買福建黃兔母兔，在發(fā)情中期屠宰黃兔，取出垂體，在液氮中充分研磨后，按照Total RNA I(OMEGA)說明書提取垂體組織總RNA。按照AMV反轉(zhuǎn)錄酶使用說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 PCR引物的設(shè)計 根據(jù)GeneBank中家兔INHBAcDNA的預(yù)測序列(XM_002713770.1)設(shè)計引物，預(yù)計擴(kuò)增的產(chǎn)物片段大小約為1 200 bp左右，上游引物5'-ATGCCCTTGCTCTGG-3'，下游引物5'-CTATGAGCAGCCACAC-3'，引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2.3 RT-PCR擴(kuò)增 用所設(shè)計的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為20 μL，其中2×Mix 10 μL、上下游引物(100 μmolomL-1)各0.2 μL、cDNA 0.2 μL、補(bǔ)充去離子水至20 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性3 min后進(jìn)入循環(huán)，循環(huán)參數(shù)94 ℃變性 30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，用1.0%瓊脂糖凝膠對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳并觀察。

1.2.4 PCR產(chǎn)物的克隆與鑒定 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒回收純化后與pMD18-T載體在16 ℃下連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，涂布含50 μg/mL氨芐青霉素LB平板，過夜培養(yǎng)，篩選陽性克隆。隨機(jī)挑取5個陽性克隆，用PCR法和雙酶切法鑒定重組質(zhì)粒。

1.2.5 序列測定及分析 將鑒定為陽性的克隆由寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行DNA測序。利用DNAStar等軟件，將所得到的cDNA序列與Genbank數(shù)據(jù)庫中已知的哺乳動物INHBA基因相應(yīng)序列進(jìn)行序列分析。

2 結(jié) 果

2.1 總RNA的分離

所分離總RNA A260/A280為1.9，瓊脂糖凝膠電泳后清晰可見18S和28S 2條核糖體RNA條帶(見圖1)，圖1說明腦垂體組織總RNA提取過程中未發(fā)生降解。

2.2 RT-PCR擴(kuò)增、PCR產(chǎn)物克隆及其鑒定

RT-PCR擴(kuò)增后，產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到明顯特異性條帶，PCR產(chǎn)物大小與預(yù)期結(jié)果一致，大約為1 200 bp(見圖2)。PCR產(chǎn)物純化后與pMD18-T載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α細(xì)胞中，經(jīng)氨芐青霉素平板篩選，隨機(jī)挑取5個陽性克隆，通過PCR和雙酶切進(jìn)行鑒定，證實擴(kuò)增克隆的片段大小均正確。

圖1 總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig. 1 Agarose electrophoresis of total RNA

圖2 福建黃兔INHBA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 2 PCR product of INHBA of Fujian Yellow Rabbit

M. D2 000 DNA Maker; I.INHBA基因擴(kuò)增條帶

M. D2 000 DNA Maker; I. amplification product ofINHBAgene

2.3 序列分析

2.3.1 黃兔INHBA基因信息 黃兔INHBAcDNA經(jīng)測序得到由1 275 bp組成的開放閱讀框(ORF)，其實密碼子為ATG，終止密碼子為TAG。將所得序列登陸到GenBank(登錄號：KC831577)。采用DNASTAR軟件分析INHBA基因cDNA序列中的A、T、G、C的含量，比例分別為23.76%、31.92%、16.24%、28.08%，G+C含量(60%)高于A+T的含量(40%)；該段序列共編碼424個氨基酸，通過SignalP 4.1 軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)預(yù)測發(fā)現(xiàn)黃兔INHBA蛋白在第20和21氨基酸之間存在信號肽的切割位點(diǎn)(D=0.793，D-cutoff=0.450)，整個蛋白包括20個氨基酸的信號肽和404個氨基酸的成熟肽(見圖3)。利用NCBI數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在線工具Conserved Domain Search Service軟件分析發(fā)現(xiàn)INHBA蛋白在第30至250氨基酸處存在1個TGF-β前肽結(jié)構(gòu)域及在第318至423氨基酸處存在1個TGF-β結(jié)構(gòu)域(見圖4)。

2.3.2 同源性序列分析 應(yīng)用Lasergene v7.1 DNAStar軟件對所測得結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，所擴(kuò)增的黃兔INHBA基因長度約為1 275 bp與靈長目中的人、大猩猩同源性分別為91.0%和91.3%，與偶蹄目中的奶牛、山羊、綿羊、豬同源性分別為89.2%、89.6%、89.7%和88.3%，與奇蹄目中的馬的同源性為88.8%，與嚙齒目中的家鼠、挪威鼠、黃金地鼠同源性分別為88.1%、87.8%、87%，與家貓的同源性為89.5%見表1。根據(jù)INHBA基因的同源性構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，黃兔與靈長目動物同源性很高見圖5。

圖3 INHBA蛋白的信號肽預(yù)測Fig. 3 Signal P prediction of INHNA protein

圖4 INHBA蛋白的結(jié)構(gòu)域Fig. 4 Structural domain of INHBA protein

表1INHBA基因在哺乳動物之間核酸同源性比較
Table 1 Homology analysis ofINHBAon nucleotides in kinds of mammalians

3 討 論

通過對INHBA基因的cDNA序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，該序列含有完整的開放式閱讀框，含有1275個核苷酸，編碼424個氨基酸的INHBA前體蛋白，其中前20個氨基酸經(jīng)預(yù)測為信號肽，21至424為成熟的INHBA蛋白。通過對福建黃兔和不同哺乳動物的INHBA基因序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，黃兔的INHBA基因與靈長目中的人、大猩猩親緣性最高，達(dá)到90%以上，與偶蹄目中的奶牛、山羊、綿羊、豬同源性介于85%～90%之間，與奇蹄目中的馬的同源性為88.8%，與嚙齒目中的家鼠、挪威鼠、黃金地鼠同源性在85%以上，在不同的哺乳動物物種間高度保守。對INHBA蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析，該蛋白含有1個TGFβ家族結(jié)構(gòu)域和1個TGFβ前體超家族結(jié)構(gòu)域，具有自分泌和旁分泌生長因子的活性，可以通過與TGFβ家族受體或TGFβ超家族受體結(jié)合，參與垂體、性腺和胎盤等多種細(xì)胞器的生長和發(fā)育[9-11]，此間接佐證了抑制素通過兩個結(jié)合蛋白：β多聚糖(TGFβ家族III受體)和抑制素結(jié)合蛋白(INHBP120)發(fā)揮生物學(xué)作用的共受體假說[3]。動物的生殖主要受下丘腦-垂體-性腺軸分泌的生殖激素調(diào)控，其中促卵泡素(FSH)和促黃體素(LH)作用于性腺，通過調(diào)節(jié)雄性動物的精子發(fā)生、成熟過程和雌性動物的排卵過程參與生殖調(diào)控[12]。INH對FSH起負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用，調(diào)控FSH的合成與分泌，進(jìn)而影響到生殖細(xì)胞的發(fā)育和成熟[13]。INHBA基因多態(tài)性主要與公畜繁殖性狀(主要為精液品質(zhì))相關(guān)[14-17]；在母畜上，小尾寒羊INHBA基因第2外顯子上檢測到的1個SNP(A218G)與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān)(P<0.05)[18]。

圖5 INHBA基因核酸序列的遺傳進(jìn)化Fig. 5 Phylogenetic tree based on the nucleotide sequences of INHBA gene

4 結(jié) 論

因此，INHBA基因可以作為篩選影響福建黃兔繁殖性狀的候選基因，對INHBA克隆和序列分析，可以為后續(xù)的多態(tài)位點(diǎn)檢測提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] Medan M S，Arai K Y，Watanabe G，et al．2007 Inhibin: Regulation of reproductive function and practical use in females[J]．Animal Science Journal，2007，78(1)：16-27．

[2] Meldi K M，Gaconnet G A，Mayo K E．DNA Methylation and histone modifications are associated with repression of the inhibin α promoter in the rat corpus luteum[J]．Endocrinology，2013,153(10)：4 905．

[3] 張 超，羅艷梅，張家樺，等．激活素、抑制素及其受體與動物生殖作用的研究進(jìn)展[J]．中國畜牧獸醫(yī)，2011，38(2)：115-119．

[4] Chand A L，Harrison C A，Shelling A N．Inhibin and premature ovarian failure[J]．Hum．Reprod．Update，2010，16(1)：39-50．

[5] Sonee M，Bogdan N，Hall L，et al．The inhibin B response to the testicular toxicant 1, 3 dinitrobenzene in male rats[J]．Birth defects research，2013，98(1)：29-34．

[6] 馬勇江，馬 毅．抑制素及其對動物繁殖的影響[J]．甘肅畜牧獸醫(yī)，2000(5)：38-40．

[7] 李曉麗，郭志云，曾憲垠．抑制素的研究進(jìn)展及其在動物繁殖中的應(yīng)用[J]．四川畜牧獸醫(yī)，2003(11)：30-32．

[8] 謝喜平，陳巖鋒，孫世坤，等．福建黃兔專門化父系選育[J]．福建農(nóng)業(yè)學(xué)報，2009，24(5)：433-437．

[9] Ying S Y. Inhibins activins and follistatins: gonadal protein modulating the secretion of FSH[J]．Endocrine Reviews，1988，9：267-293．

[10] Vale W，Rivier J．Purification and characterization of a FSH releasing protein from porcine ovarian follicular fluid[J]．Nature，1986，321：776-779．

[11] Findlay J K．An update on the roles of inhibin, activins and follistratin aslocal regular of folliculogenesis[J]．Bio Reprod．1993，48：15-23．

[12] Sairam M R，Krishnamurthy H．The role of follicle stimulating hormone in spermatogenesis： lessons from knockout animal models[J]．Arch Med Res，2001，32(6)：601-608．

[13] 田 錦，李志民，傅 衍，等．抑制素、活化素和卵泡素研究進(jìn)展[J]．動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2008，29(12)：77-81．

[14] Lin C L，Ponsuksili S，Tholen E，et al．Candidate gene makers for sperm quality and fertility of boar[J]．Animal Reproduction Science，2005，92(3)：349-363．

[15] Giesecke K，Hamann H，Sieme H，et al．IHNBA-associated markers as candidates for stallion fertility[J]．Reproduction in Domestic Animals，2010，45(2)：342-247．

[16] Sang L， Du Q Z， Yang W C，et al．Polymorphisms in follicle stimulation hormone receptor，inhibin alpha，inhibin bata A，and prolactin genes，and their association with sperm quality in Chinese Holstein bulls[J]．Animal Reproduction Science，2011，126(3)：151-156．

[17] Shelling A N，Burton K A，Chand A L，et al．Inhibin：a candidate gene for premature ovarian failure[J]．Hum Reprod，2000，15(12)：2 644-2 649．

[18] Chu M X，Xiao C T，F(xiàn)u Y，et al．PCR-SSCP Polymorphism of Inhibin βA Gene in Some Sheep Breeds[J]．Asian-Aust J．Anim Sci，2007，20(7)：1 023-1 029．