海南黑山羊CAST基因的時空表達(dá)分析

管 凇，周漢林，侯冠彧，王東勁，徐鐵山

(中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶作物品種資源研究所，海南 儋州 571737)

隨著人們生活水平的不斷提高，消費者對肉的嫩度和肉質(zhì)方面的要求也越來越高。肉的嫩度是影響肉質(zhì)的重要因素，因此,如何提高畜禽肉品質(zhì)已成為畜禽育種工作者的新目標(biāo)[1]。

根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶系統(tǒng)是一種存在于細(xì)胞內(nèi)的限制性蛋白水解酶，與肉質(zhì)的嫩度和風(fēng)味等食用品質(zhì)密切相關(guān)。在肌肉組織中，鈣蛋白酶系統(tǒng)控制著肌纖維蛋白的降解，是肌肉蛋白質(zhì)降解的限速酶，在肌原纖維更新和宰后嫩化中扮演著重要角色[2]，而且在細(xì)胞內(nèi)普遍存在并參與大量的生長和代謝過程[3]。其中，鈣調(diào)蛋白酶抑制蛋白(caplastatin, CAST)是鈣調(diào)蛋白酶系統(tǒng)的一種內(nèi)源抑制劑，它可以識別鈣蛋白酶與鈣結(jié)合引起的構(gòu)象變化并與之特異性結(jié)合，參與肌肉生長過程中蛋白質(zhì)的更新，在肉用畜禽中顯著影響屠宰后肉的嫩度[4]。

由于骨骼肌蛋白質(zhì)的含量對肉質(zhì)的影響很大，因而，CAST基因已成為研究肌肉生長和肉質(zhì)性狀的候選基因[5]。目前，針對CAST基因在牛、豬、羊、雞等畜禽方面的研究，多見其遺傳標(biāo)記多態(tài)性與組織學(xué)特征、肌纖維性狀、肉質(zhì)性狀等的相關(guān)性研究[6]，有關(guān)CAST基因在畜禽肉品質(zhì)嫩化過程中的調(diào)控機(jī)理研究較少。本研究利用實時熒光定量PCR技術(shù)，探討CAST基因在海南黑山羊骨骼肌、心肌、肝臟和脂肪組織中的表達(dá)差異及其發(fā)育變化規(guī)律，以進(jìn)一步揭示CAST基因的生物學(xué)功能及其對肉質(zhì)的表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院實驗羊場的海南黑山羊1、2、3、4月齡公羔和12月齡公羊各三只(相同營養(yǎng)水平，相同飼養(yǎng)環(huán)境)屠宰后取心肌、骨骼肌、脂肪和肝臟，置液氮速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要儀器和試劑

所用主要儀器包括核酸提取儀Maxwell 16(Promega公司)，熒光定量PCR儀(eppendorf)，PCR儀(德國Biometra)，凝膠成像系統(tǒng)(法國VILBER)，紫外分光光度計測；RNA提取試劑盒(Maxwell 16 Total RNA Purification Kit)購自Promega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒(SYBR Premix Ex TaqTM )購自大連寶生物。

1.3 熒光定量PCR

1.3.1 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 利用核酸提取儀提取總RNA，操作步驟按照Maxwell 16 Total RNA Purification Kit試劑盒說明書進(jìn)行操作，RNA用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，用紫外分光光度計測其濃度，將每個樣品稀釋成一致濃度備用。反轉(zhuǎn)錄體系為：5×prime ScriptTM Buffer (for Real Time)20 μL，終濃度1×；Prime ScriptTM RT Enzyme Mix I 1.0 μL；Oligo dT Primer (50 pM) 1.0 μL，終濃度20 pmol；Random 6 mers (100 μM) 1.0 μL，終濃度50 pmol；Total RNA 1.0 μL；Rnase Free ddH2O up to 15 μL。反轉(zhuǎn)錄條件為：37℃，15 min；85 ℃，5 S。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA放置-30 ℃ 冰箱保存待用。

1.3.2 引物設(shè)計 參照GenBank已知序列，利用Primer5.0設(shè)計引物，送上海英俊生物技術(shù)有限公司合成，引物信息見表1。

表1 熒光定量RT-PCR所用引物的相關(guān)信息Table 1 Real time RT-PCR primer information

注：β-Actin 為內(nèi)參基因。

Notes：β-Actin used as housekeeping gene.

1.3.3 實時熒光定量 PCR 本試驗采用SYBR Green I 染料法進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，在realplex4型實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為25 μL：其中SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL, 引物(10 pmol/ L)1 μL, cDNA模板2 μL，ddH2O 9.5 μL，95 ℃預(yù)熱30 s，PCR循環(huán)參數(shù)為：95 ℃變性5 s，57 ℃退火20 s；72 ℃延伸15 s，42次循環(huán)；根據(jù)擴(kuò)增曲線和溶解曲線進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 統(tǒng)計分析

在保證擴(kuò)增效率的前提下，參照Winer等[7]方法，用2-△△Ct法度量CAST基因的mRNA相對表達(dá)量，以β-Actin為內(nèi)參基因進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化校準(zhǔn)。所得數(shù)據(jù)采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件One-way ANOVA進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CAST基因在不同生長時期四種組織中的表達(dá)

CAST基因在海南黑山羊不同生長時期四種組織中的mRNA表達(dá)變化見圖1，結(jié)果表明，該基因在12月齡心肌組織中的mRNA表達(dá)量極顯著高于1、2、3、4月齡；心肌表達(dá)模式為：12月齡>2月齡>1月齡>3月齡>4月齡，在1、2、3、4各月齡間，差異不顯著(P>0.05)；骨骼肌中mRNA表達(dá)模式與心肌的表達(dá)模式有所不同，2月齡骨骼肌中mRNA表達(dá)量極顯著高于1、3、4月齡和12月齡(P<0.01)，但在3、4月齡間的骨骼肌中的mRNA表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，表達(dá)模式為：2月齡>12月齡>1月齡>3月齡>4月齡，該基因在脂肪和肝臟組織中的mRNA表達(dá)模式基本一致，即，12月齡>1月齡>2月齡>3月齡>4月齡；12月齡時，脂肪和肝臟中的mRNA表達(dá)量極顯著高于1、2、3、4月齡(P<0.01)，但在2、3、4月齡間，脂肪和肝臟中的mRNA表達(dá)量不存在顯著差異(P>0.05)。

圖1 CAST基因在海南黑山羊不同生長時期四種組織中的表達(dá)變化規(guī)律Fig. 1 The developmental changes of CAST mRNA in 4 tissues in different period of Hainan Black Goat

注：不同的字母之間表示差異極顯著(P<0.01)，相同的大寫字母與小寫字母之間表示差異顯著(0.010.05)。下同。

Note: Different letters mean extreme difference (P<0.01), the same capitalized letters and different lowercases mean significant differences (0.010.05). The same below.

2.2 CAST基因在同一生長時期各種組織中的表達(dá)差異

CAST基因在同一生長時期各組織中的表達(dá)模式見圖2。由圖2可知，1月齡時，該基因在骨骼肌中的mRNA表達(dá)量極顯著大于肝臟、心肌和脂肪，表達(dá)模式為：骨骼肌>肝臟>心肌>脂肪；2月齡時，該基因骨骼肌中的表達(dá)量極顯著上升，且極顯著大于肝臟、心肌和脂肪(P<0.01)，表達(dá)模式為：骨骼肌>心肌>肝臟>脂肪；3月齡和4月齡時，該基因在骨骼肌、肝臟、心肌、和脂肪中的mRNA表達(dá)量明顯下降，表達(dá)量較低，骨骼肌中的mRNA表達(dá)量極顯著高于其他組織(P<0.01)，脂肪和肝臟之間的mRNA表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，表達(dá)模式為：骨骼肌>肝臟>脂肪>心?。?2月齡時，該基因在心肌、骨骼肌和肝臟中的mRNA表達(dá)量極顯著上升(P<0.01)，且在心肌和肝臟中的表達(dá)量到達(dá)最高，在脂肪中的表達(dá)量較低。

圖2 CAST基因在海南黑山羊不同生長時期四種組織中的表達(dá)差異Fig. 2 The differences of CAST mRNA in 4 tissues in the same period of Hainan Black Goat

注：不同的字母之間表示差異極顯著(P<0.01)，相同的字母之間表示差異不顯著(P>0.05)。

Note: Averages between the different letters means extreme significant difference (P<0.01), averages between the same letters indicate no significant difference (P>0.05).

以上結(jié)果提示，CAST基因在山羊各組織中的調(diào)節(jié)作用廣泛，對骨骼肌的影響最大，其他組織的影響較小，特別是對2月齡的未成年羊，該基因在這一時期骨骼肌中的高表達(dá)量是否意味著此時是山羊生長速度最快，肉質(zhì)最好的時期，此結(jié)論有待進(jìn)一步探討；另外，該基因時空表達(dá)規(guī)律復(fù)雜，不同組織，時空表達(dá)規(guī)律有所差異，表達(dá)量并沒有隨著月齡的增加呈一直上升或者下降趨勢，其中有升有降。該基因在山羊其他生長時期的時空表達(dá)規(guī)律有待進(jìn)一步探討。

3 討 論

鈣蛋白酶抑制蛋白(CAST)基因是廣泛存在于動物體內(nèi)的一種鈣蛋白酶依賴的特異性抑制劑[8]，研究表明，改變鈣蛋白酶-鈣蛋白酶抑素系統(tǒng)的活性可以改變?nèi)獾哪鄱萚9]。前人對CAST基因在動物中的表達(dá)規(guī)律作了大量研究，Barnoy等[10]發(fā)現(xiàn)大鼠從胚胎期成肌細(xì)胞融合為多核細(xì)胞過程中CAST基因的表達(dá)量顯著降低。Pringle等[11]研究發(fā)現(xiàn)CAST基因與μ-calpain的活性比值與牛肉嫩度存在高度相關(guān)性。Morgan等[12]研究表明，閹割過的公牛背最長肌中CAST活性顯著升高，肌肉蛋白質(zhì)降解速度顯著降低，從而使其具有更快的生長速度和更高的瘦肉率。燕鳳等[13]研究結(jié)果表明，CAST基因mRNA表達(dá)水平對綿羊的肉嫩度、多汁性及大理石紋起負(fù)調(diào)控作用，綿羊CAST基因在肌肉組織中的mRNA水平隨日齡的增加而增加。林亞秋等[14]研究結(jié)果顯示，CAST基因在九龍牦牛多種組織中均有表達(dá)，其中，在心臟組織中表達(dá)量最高, 在脂肪組織中表達(dá)量最低。

本研究結(jié)果表明，CAST基因在未成年羊的骨骼肌中mRNA表達(dá)量極顯著高于其他組織(P<0.01)，且在2月齡時達(dá)到最高水平；成年后在心肌、肝臟和脂肪中的表達(dá)量極顯著升高(P<0.01)，在骨骼肌中的表達(dá)量次之，但在脂肪中的表達(dá)量始終相對較低；這一結(jié)論與林亞秋等[14]有相似之處。劉安芳等[15]研究結(jié)果表明，CAST基因在不同雞品種的胸肌、心肌、肝、脾、肺、腎、肌胃、腦、小腸、卵巢組織樣中均有表達(dá)，且在肌肉組組織中表達(dá)量顯著高于其他組織，其次在肝臟中的表達(dá)量也較高。這一觀點與本研究中CAST基因在未成年羊中的表達(dá)模式相似，以上研究進(jìn)一步驗證了本研究結(jié)果的可靠性。另外，該基因在3、4月齡各組織中的mRNA表達(dá)量相對較低，且四種組織在3、4月齡間表達(dá)差異不顯著(P>0.05),此結(jié)論需要更多系統(tǒng)的、連續(xù)性的數(shù)據(jù)作為參照至進(jìn)一步探討。關(guān)于該基因在其他生長時期和其他組織中的表達(dá)模式有待進(jìn)一步研究，推測該基因在不同組織、不同發(fā)育階段的表達(dá)特點有所差異。隨著對CAST基因的深入研究，如果通過基因調(diào)控技術(shù)提高或降低CAST在肌肉組織中的表達(dá)量來控制CAST的活性，以控制肌原纖維蛋白質(zhì)的降解，從分子水平上控制肌肉的嫩度，從而達(dá)到提高肌肉生長和改善肉質(zhì)的目的，這對于提高畜禽肉的品質(zhì)具有十分重要的意義[15]。該試驗為進(jìn)一步研究CAST基因?qū)θ赓|(zhì)的表達(dá)調(diào)控機(jī)理提供了參考依據(jù)。

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