四妙勇安湯合失笑散對急性心肌梗死模型大鼠VEGF表達(dá)的影響*

張淑芹 陶 紅 劉翠文

（1.河北省秦皇島市中醫(yī)院，河北 秦皇島 066000；2.河北省唐山市豐潤區(qū)第二人民醫(yī)院，河北 唐山 064000）

急性心肌梗死屬中醫(yī)學(xué)“胸痹”“、真心痛”等病證，筆者認(rèn)為其基本病機(jī)特點為正氣虧虛、毒瘀阻絡(luò)。臨床大量報道四妙勇安湯及失笑散治療急性心肌梗死療效顯著［1-4］。本實驗就四妙勇安湯合失笑散對內(nèi)皮細(xì)胞生長因子表達(dá)的影響展開研究，以探討其治療急性心肌梗死的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 雄性健康Wistar大鼠60只，體質(zhì)量180～220 g，清潔級。由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，動物合格證號為CXX（京）2007-0001。

1.2 藥物與試劑 四妙勇安湯合失笑散（由當(dāng)歸30 g，金銀花 30 g，玄參 20 g，甘草 15 g，蒲黃 6 g，五靈脂 6 g，濃縮成2 g/mL的生藥煎劑）：由本院中藥制劑室提供。

1.3 儀器與試劑 TRIZOL Reagent（Invitrogen）；R Tmaster Mix，Taq DNA polymerase，引物及探針由大連寶生物公司提供。見表1。標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒由上海基康生物科技有限公司提供。大鼠VEGF Elisa試劑盒，由武漢博士德生物科技有限公司提供，批號：EK0540。slan熒光定量PCR儀（上海宏石）。Bio-mini分光光度計（日本島津）。550型酶標(biāo)儀（美國伯樂）。

1.4 模型制備 建立大鼠急性心肌梗死模型。大鼠麻醉后仰位固定，從胸骨左側(cè)第3、4肋間正中線旁開5 mm行縱向切口，將心臟輕輕擠出，于左心耳根部下方2～3 mm處穿線，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，建立心肌缺血模型。結(jié)扎后迅速將心臟還納，關(guān)閉胸腔，恢復(fù)自主呼吸。手術(shù)前后記錄心電圖，以術(shù)后Ⅱ?qū)?lián)心電圖ST段弓背向上抬高為模型復(fù)制成功的標(biāo)志。術(shù)后連續(xù)3 d注射青霉素80萬U／d以預(yù)防感染。假手術(shù)組只開胸穿線，不結(jié)扎冠脈，其余操作同上。

1.5 分組及給藥 60只SD大鼠隨機(jī)分為5組：四妙勇安湯合失笑散大、中、小劑量組、假手術(shù)組、模型組各12只。四妙勇安湯合失笑散大、中、小劑量組和模型組于手術(shù)前 6 d 開始灌胃，劑量分別為 28、14、7 g/（kg·d），第6日進(jìn)行造模，對照組于相同時間給予滅菌蒸餾水2 mL灌胃。每日 2次，分別再灌胃 10 d［5］。

1.6 標(biāo)本采集與檢測

1.6.1 實時熒光定量PCR檢測VEGF mRNA的表達(dá)水平 取心肌組織組織，用Trizol法提取總RNA，檢測RNA純度及濃度。取純度好的樣品進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，10 μL反應(yīng)體系，cDNA置-20℃保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系為 25 μL：Taq 酶 12.5 μL，10 μΜ 上、 下游引物各0.5 μL，3 μΜ 熒光探針 1 μL， 模板 （cDNA）2 μL，補(bǔ)DEPC水至25 μL。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性60 s，95℃10 s、6℃ 30 s擴(kuò)增40個循環(huán)，在60℃讀取熒光。每個樣品設(shè)3個平行復(fù)孔取均值。用內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理后進(jìn)行相對定量分析。

表1 引物及探針序列

1.6.2 ELISA法測定 耳中央動脈血清VEGF濃度。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠心肌VEGF mRNA表達(dá)變化 見表2。結(jié)果表明，模型組VEGF mRNA表達(dá)水平較假手術(shù)組有升高（P＜0.05），其他各組較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，四妙勇安湯合失笑散大、中劑量組VEGF mRNA表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01），小劑量組略有升高（P＞0.05）。

2.2 各組血清VEGF濃度變化 見表3。研究表明，模型組血清VEGF含量較假手術(shù)組有升高（P＜0.05），其他各組較假手術(shù)組顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比較，四妙勇安湯合失笑散大、中劑量組VEGF含量顯著升高（P＜0.01），四妙勇安湯合失笑散小劑量組略有升高（P＞0.05）。

表2 各組大鼠心肌VEGF mRNA表達(dá)比較（）

表2 各組大鼠心肌VEGF mRNA表達(dá)比較（）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。下同。

表3 各組大鼠血清VEGF蛋白濃度比較（）

表3 各組大鼠血清VEGF蛋白濃度比較（）

3 討 論

急性冠狀動脈綜合征是指急性心肌缺血引起的一組臨床癥狀，包括ST段抬高心肌梗死、非ST段抬高心肌梗死和不穩(wěn)定型心絞痛，已成為臨床常見的嚴(yán)重心血管疾病。其主要發(fā)病機(jī)制是在破裂的動脈粥樣硬化斑塊基礎(chǔ)上形成血栓，進(jìn)而完全或不完全堵塞冠狀動脈，造成心肌急性缺血。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子（VEGF）是一種特異作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞的多功能細(xì)胞因子，屬于血小板源生長因子家族成員，是促血管生成的主要因素之一。VEGF及其受體在血管新生中起著最關(guān)鍵的作用，調(diào)控著內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、管腔形成等重要環(huán)節(jié)［6］。血清低水平的VEGF會造成急性心肌?；颊甙l(fā)生多種并發(fā)癥的危險［7］。

四妙勇安湯具有滋陰養(yǎng)血，清毒祛瘀的功效。綠原酸和阿魏酸分別為金銀花和當(dāng)歸的主要有效成分，具有心血管保護(hù)作用。失笑散屬理血劑，由五靈脂和蒲黃兩味藥組成，具活血化瘀，散結(jié)止痛之功效，主治瘀血停滯。研究資料表明，活血化瘀中藥可擴(kuò)張血管口徑，增加血流量，改善微循環(huán)和血液流變學(xué)，降低微血管內(nèi)血細(xì)胞的聚集，延長凝血及血栓形成時間的作用。該類藥物還可以促進(jìn)VEGF及其他多種細(xì)胞因子表達(dá)［8-9］。

本實驗結(jié)果提示：四妙勇安湯合失笑散可增高血清中VEGF含量；同時可上調(diào)心肌VEGF mRNA的表達(dá)，其中大劑量組的作用最好。所以四妙勇安湯合失笑散治療心肌梗死的機(jī)制有可能是通過促進(jìn)心肌梗死大鼠心肌VEGF的表達(dá)、分泌，從而促進(jìn)梗死心肌血管新生。

［1］崔文利，楊明霞，梁春香.失笑散加味治療冠心病心絞痛87例臨床觀察［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2000，9（6）：510.

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［6］Carrato A，Gallego-Plazas J，et al.Anti-VEGF therapy：a new approach to colorectal cancer therapy［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2006，6（10）：1385-1396.

［7］Matsudaira K，Maeda K，Okumura N，et al.Impact of low levels of vascular endothelial growth factor after myocardial infarction on 6-month clinical outcome.Results from the Nagoya Acute Myocardial Infarction Study［J］.Circ J 2012，76（6）：1509-1516.

［8］李強(qiáng)，孫建寧，夏曉暉.失笑散及其不同提取部位的藥效學(xué)研究［J］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，1999，22（3）：48-49.

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