加味四逆散對(duì)身心應(yīng)激模型大鼠胃腸功能及胃組織中GASR和空腸組織中VIPR2mRNA表達(dá)的影響

謝慧臣，劉 芬，楊 強(qiáng)，熊常初，田春曼

（湖北民族學(xué)院醫(yī)學(xué)院中醫(yī)教研室，湖北 恩施 445000）

隨著人們生活節(jié)奏越來越快，各種社會(huì)問題不斷出現(xiàn)，應(yīng)激性心理、生理反應(yīng)因人們心理情感上的種種變化而不斷積累，導(dǎo)致各種身心疾病的發(fā)生，其中與胃腸道疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系尤為密切［1］，而應(yīng)激致病和中醫(yī)病因?qū)W中的情志所傷內(nèi)在涵義是一致的。文獻(xiàn)［2］報(bào)道：中醫(yī)疏肝理氣法的治病機(jī)理與該方法對(duì)胃腸激素水平施加了有益的影響有關(guān)，而胃腸激素的作用效果又與表達(dá)受體的數(shù)目關(guān)系密切，即受體水平的高低可很好地反映該激素的作用強(qiáng)度，但目前有關(guān)身心應(yīng)激致胃動(dòng)力障礙、神經(jīng)內(nèi)分泌改變的文獻(xiàn)報(bào)道尚不多見。加味四逆散（Jiaweisinisan，JWSNS）來源于中醫(yī)疏肝理氣法之經(jīng)典方四逆散，前期大量臨床觀察［3－4］及實(shí)驗(yàn)研究已證明其有調(diào)節(jié)患者胃腸功能和修復(fù)應(yīng)激模型大鼠受損胃黏膜及改善黏膜下血流量的作用。本文作者從實(shí)驗(yàn)角度進(jìn)一步探索該方對(duì)慢性身心應(yīng)激模型大鼠胃腸激素受體表達(dá)和胃腸動(dòng)力及下丘腦－垂體－腎上腺（HPA）軸的影響，以期從腦腸肽受體角度探討JWSNS調(diào)治身心應(yīng)激相關(guān)性胃腸疾病的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組雄性清潔級(jí)健康Wistar大鼠60只，10～12周齡，體質(zhì)量為（200±20）g，購(gòu)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SRST（鄂）20110018。大鼠平衡喂養(yǎng)1周后隨機(jī)分為正常組，模型組，西沙比利組和小、中、大劑量JWSNS組，每組均為10只。

1.2 藥物、試劑及實(shí)驗(yàn)儀器 JWSNS（柴胡8g、枳實(shí)15g、白芍15g、郁金6g、白芨6g、砂仁12g、炙甘草6g）購(gòu)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院中藥房，按標(biāo)準(zhǔn)方法制成水劑（含生藥1g·mL－1），4℃保存。西沙比利片（5mg／片），山東齊魯藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：110603，蒸餾水配制藥液（濃度0.4g·L－1）。半固體營(yíng)養(yǎng)糊配制參考文獻(xiàn)［5］：蒸餾水100mL配羥甲基纖維素6g、糖5g、碳素墨水3mL、奶粉9g、淀粉5g，充分?jǐn)嚢璩珊隣睿?℃保存。cAMP、cGMP藥盒，南京建成生物有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：101120。GASR mRNA、VIPR2mRNA實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒、引物（Invitrogen Biotechnology Co.，LTD中國(guó)公司），PCR引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度和退火溫度見表1。SLAN熒光定量PCR檢測(cè)系統(tǒng)（上海宏石醫(yī)療科技有限公司）；SN－695型放免γ計(jì)數(shù)器（上海日環(huán)光電儀器有限公司）。

表1 PCR引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度和退火溫度Tab.1 Primer sequences of PCR，length of products and annealing temperature

1.3 模型制備 按文獻(xiàn)［6］取10種不可預(yù)知因素刺激大鼠。①潮濕墊料加傾斜飼養(yǎng)：鼠籠傾斜30°，持續(xù)24h。②熱水泳：受試大鼠于水溫48℃、水深35cm熱水中放置10min。③禁食24h。④電擊：電流0.1mA，每分鐘3次，刺激15min。⑤行為束縛2h。⑥陌生物品：隨機(jī)選擇發(fā)聲的收音機(jī)、鐵絲網(wǎng)等，放入鼠籠24h。⑦晝夜交替：白晝以黑布罩著鼠籠持續(xù)12h，天黑后拿掉并用白熾燈持續(xù)照射12h。⑧陌生氣味：醫(yī)用棉花蘸取冰醋酸放入玻璃瓶，瓶口開放，放入鼠籠24h。⑨冰水泳：受試大鼠于水溫4℃、水深35cm冰水中放置10min。⑩禁水24h。每日隨機(jī)取1種，相鄰2d不重復(fù)；持續(xù)4周。

1.4 配制劑量與給藥方法 小、中、大劑量JWSNS組及西沙比利組大鼠每日用藥濃度按等效臨床劑量和體表面積公式計(jì)算分別設(shè)定為0.25、0.50、1.00g·mL－1和0.40g·L－1，以上藥物均用蒸餾水配制，每日將配置好的中藥煎劑和西沙比利混懸液2mL灌胃大鼠?？瞻捉M及模型組大鼠用生理鹽水2mL灌胃，均為每日1次，從造模第3周開始灌胃，共2周。

1.5 檢測(cè)下丘腦中cAMP和cGMP含量 大鼠最后一次給藥后禁食不禁水，24h后灌胃半固體糊，記錄灌胃總質(zhì)量，30min后脫頸椎處死大鼠剝離下丘腦，放射免疫法檢測(cè)下丘腦中cAMP和cGMP含量。

1.6 測(cè)定胃排空率和小腸推進(jìn)比 取大鼠胃及小腸組織，直尺測(cè)量小腸總長(zhǎng)及腸內(nèi)糊狀物推進(jìn)距離，小腸推進(jìn)比為腸內(nèi)糊狀物推進(jìn)距離／小腸總長(zhǎng)×100%。稱量全胃，蒸餾水洗凈胃內(nèi)容物，蘸干后再稱質(zhì)量，胃排空率＝［1－（第1次稱重－第2次稱重）／半固體糊總灌胃量］×100%［5］。

1.7 檢測(cè)GASR mRNA和VIPR2mRNA相對(duì)表達(dá)量 胃竇及空腸區(qū)取適量組織，RT－PCR法測(cè)定胃組織中GASR和空腸組織中VIPR2mRNA的表達(dá)并定量分析。PCR反應(yīng)體系為：2×qPCR Mix 12.5μL，2.5μmol·L－1基因引物2.0μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2.0μL。具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。結(jié)果處理：ΔΔCT法：A＝CT（目的基因，待測(cè)樣本）－CT（內(nèi)標(biāo)基因，待測(cè)樣本）；B＝CT（目的基因，對(duì)照樣本）－CT（內(nèi)標(biāo)基因，對(duì)照樣本）；K＝A－B，胃組織中GASR和空腸組織中VIPR2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量以表達(dá)倍數(shù)2－K表示。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理，大鼠下丘腦中cAMP和cGMP含量、胃排空率、小腸推進(jìn)比以及胃腸GASR mRNA和VIPR2mRNA相對(duì)表達(dá)量均以表示，組間比較均采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 JWSNS作用下模型大鼠下丘腦中cAMP和cGMP含量變化 與正常組比較，模型組大鼠下丘腦中cAMP和cGMP含量明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，JWSNS各治療組大鼠下丘腦中cAMP和cGMP含量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；與西沙比利組比較，大劑量JWSNS組cAMP和cGMP含量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；與小劑量JWSNS組比較，中和大劑量JWSNS組cAMP和cGMP含量均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表2。

2.2 JWSNS作用下模型大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)比變化 與正常組比較，模型組大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)比明顯降低（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組大鼠胃排空率均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；與西沙比利組比較，大劑量JWSNS組胃排空率變化不明顯（P＞0.05）；與小劑量JWSNS組比較，中和大劑量JWSNS組大鼠胃排空率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。與模型組比較，各治療組大鼠小腸推進(jìn)比均顯著升高（P＜0.01）；與西沙比利組比較，大劑量JWSNS組大鼠小腸推進(jìn)比明顯升高（P＜0.05），而小和中劑量JWSNS組差異不明顯（P＞0.05）；與小劑量JWSNS組比較，中和大劑量JWSNS組大鼠小腸推進(jìn)比明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）。見表3。

表2 JWSNS作用下模型大鼠下丘腦cAMP和cGMP含量Tab.2 The contents of hypothalamus cAMP and CGMP in model rats after treated with JWSNS［n＝10，，mB／（μmol·g－1）］

表2 JWSNS作用下模型大鼠下丘腦cAMP和cGMP含量Tab.2 The contents of hypothalamus cAMP and CGMP in model rats after treated with JWSNS［n＝10，，mB／（μmol·g－1）］

＊P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Xishabilly group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs small dose of JWSNS group.

Group cAMP cGMP Control 0.601±0.020 0.050±0.010 Model 1.411±0.040＊ 0.140±0.040＊Xishabilly 0.887±0.030△△ 0.072±0.010△△JWSNS Small dose 1.002±0.030△ 0.102±0.020△Middle dose 0.899±0.040△△▲0.078±0.010△△▲Big dose 0.684±0.030△△##▲▲0.059±0.020△△#▲▲

表3 JWSNS作用下模型大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)比Tab.3 The gastric emptying rates and small intestinal propulsion ratios in model rats after treated with JWSNS（n＝10，，η／%）

表3 JWSNS作用下模型大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)比Tab.3 The gastric emptying rates and small intestinal propulsion ratios in model rats after treated with JWSNS（n＝10，，η／%）

＊P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Xishabilly group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs small dose of JWSNS group.

Group Gastric emptying rateSmall intestinal propulsion ratio Control 68.12±5.01 60.11±3.02 Model 30.98±5.97＊ 36.01±4.14＊Xishabilly 78.15±4.02△△ 55.03±4.04△△JWSNS Small dose 55.93±3.14△ 47.10±3.01△△Middle dose 67.98±3.01△△▲ 56.02±5.01△△▲Big dose 77.89±3.97△△▲▲64.98±2.96△△#▲▲

2.3 JWSNS作用下模型大鼠胃組織中GASR mRNA和空腸組織中VIPR2mRNA相對(duì)表達(dá)量變化 與正常組比較，模型組大鼠胃組織中GASR mRNA明顯降低（P＜0.01），空腸組織中VIPR2 mRNA明顯升高（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組大鼠胃組織中GASR mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升 高（P＜0.05 或 P＜0.01），空 腸組織中VIPR2mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；與西沙比利組比較，中和大劑量JWSNS組大鼠胃組織中GASR mRNA相對(duì)表達(dá)量明 顯升高（P＜0.05 或 P＜0.01），大劑量JWSNS組大鼠空腸組織中VIPR2mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.01）；與小劑量JWSNS組大鼠比較，中和大劑量JWSNS組大鼠胃組織中GASR mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），空腸組織中VIPR2mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表4。

表4 JWSNS作用下模型大鼠胃組織中GASR mRNA和空腸組織中VIPR2mRNA相對(duì)表達(dá)量Tab.4 The relative expression quantities of GASR mRNA in stomach tissue and VIPR2mRNA in jejunal tissue in model rats after treated with JWSNS （n＝10，）

表4 JWSNS作用下模型大鼠胃組織中GASR mRNA和空腸組織中VIPR2mRNA相對(duì)表達(dá)量Tab.4 The relative expression quantities of GASR mRNA in stomach tissue and VIPR2mRNA in jejunal tissue in model rats after treated with JWSNS （n＝10，）

＊P＜0.01 vs control group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs model group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Xishabilly group；▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs small dose of JWSNS group.

Group GASR mRNA VIPR2mRNA Control 1.00±0.10 1.00±0.20 Model 0.19±0.05＊ 3.40±0.57＊Xishabilly 0.43±0.03△△ 1.79±0.35△△JWSNS Small dose 0.25±0.02△ 2.39±0.36△Middle dose 0.53±0.03△△#▲ 1.83±0.30△△▲Big dose 0.62±0.05△△##▲▲ 1.15±0.33△△##▲▲

3 討 論

心理應(yīng)激引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生的生理學(xué)效應(yīng)包括神經(jīng)內(nèi)分泌激活和炎癥反應(yīng)等［7］，最常見的是消化性潰瘍。而動(dòng)物應(yīng)激模型在應(yīng)激研究領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用，對(duì)臨床藥物的篩選和評(píng)價(jià)，臨床疾病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制以及預(yù)后評(píng)估都有不可替代的作用［8］。有報(bào)道［9］指出：可預(yù)知應(yīng)激會(huì)造成動(dòng)物適應(yīng)應(yīng)激反應(yīng)從而影響造模的效果，身心刺激的不可預(yù)知性是造模過程中避免動(dòng)物產(chǎn)生適應(yīng)性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。本文作者將多種應(yīng)激方法通過慢性不可預(yù)知的方式隨機(jī)組合，相鄰2d不重復(fù)，可更逼真地模擬現(xiàn)實(shí)生活中情志因素引發(fā)心身疾病的過程，以此制作大鼠慢性心理性應(yīng)激胃潰瘍模型更為合理。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：應(yīng)激對(duì)胃腸動(dòng)力產(chǎn)生了明顯的抑制，使胃排空和腸推進(jìn)受阻。說明應(yīng)激原對(duì)消化系統(tǒng)的影響確切，同時(shí)也說明應(yīng)激模型制備成功。有資料［10］顯示：隨著應(yīng)激時(shí)間的延長(zhǎng)，胃排空的抑制程度也不斷增強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)JWSNS干預(yù)后，大鼠胃腸動(dòng)力得到明顯改善，全方表現(xiàn)出較好的促胃腸動(dòng)力及鎮(zhèn)痛等藥效學(xué)作用。

文獻(xiàn)［11］表明：應(yīng)激性胃潰瘍發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)遞質(zhì)調(diào)節(jié)有關(guān)。cAMP和cGMP是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的神經(jīng)遞質(zhì)，同時(shí)也是神經(jīng)細(xì)胞功能的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)，在細(xì)胞代謝及多種生理效應(yīng)中起到了關(guān)鍵的作用。胃潰瘍患者胃腸動(dòng)力改變往往與神經(jīng)遞質(zhì)含量改變有關(guān)，應(yīng)激導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生身心反應(yīng)的重要原因是激活了下丘腦－垂體－腎上腺（HPA）軸［12］，而環(huán)核苷酸系統(tǒng)（cAMP、cGMP）作為激活過程中的第二信使，具有激素樣的作用，其在應(yīng)激狀態(tài)下的表達(dá)增強(qiáng)從分子水平上體現(xiàn)了機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的異常改變及腦神經(jīng)系統(tǒng)的損害程度，對(duì)慢性身心應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制的闡明具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：大鼠慢性身心應(yīng)激胃潰瘍模型下丘腦cAMP和cGMP含量增加顯著，提示慢性身心應(yīng)激可導(dǎo)致神經(jīng)元的損害。JWSNS通過調(diào)節(jié)環(huán)核苷酸系統(tǒng)而抑制了應(yīng)激對(duì)神經(jīng)元的損害進(jìn)而改善了胃腸功能。腦腸肽存在于中樞及腸道神經(jīng)系統(tǒng)，具有調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)、分泌吸收等復(fù)雜的功能，并受情緒影響［13］。GAS可直接收縮胃平滑肌細(xì)胞，但要通過受體介導(dǎo)；VIP2是調(diào)節(jié)胃腸運(yùn)動(dòng)的重要物質(zhì)，但需與受體結(jié)合才可產(chǎn)生偶聯(lián)放大效應(yīng)作用于平滑肌使之舒張［14］。本文作者選擇GASR和VIPR2為代表進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)模型大鼠GASR減少，而VIP2受體增加明顯，說明應(yīng)激時(shí)胃腸平滑機(jī)細(xì)胞存在促進(jìn)2種受體異常表達(dá)的機(jī)制，但這與組織內(nèi)的胃腸激素表達(dá)似乎并不一致［15］，提示激素的升高和降低并不一定是矛盾的主要方面，而是取決于表達(dá)受體的數(shù)目。JWSNS對(duì)腦腸肽受體具有較好的調(diào)節(jié)作用，提示其在胃腸道運(yùn)動(dòng)中起重要調(diào)節(jié)和多靶點(diǎn)的整體調(diào)治作用。

JWSNS源于張仲景的經(jīng)典名方四逆散，在原方調(diào)暢氣機(jī)法的基礎(chǔ)上輔以祛濕活血之藥組成加味四逆散。方中以疏肝理氣之柴胡、枳實(shí)為君，臣以白芍，砂仁，白芨柔肝健脾和胃、行氣調(diào)中祛濕、兼以收斂，佐以郁金行氣活血解郁，使以炙甘草調(diào)和諸藥、補(bǔ)脾益氣。全方體現(xiàn)了中醫(yī)身心兼顧、標(biāo)本同治的理念。

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