二甲基砜／聚乙烯醇水凝膠的制備及其生物學(xué)特性評價

王 昊，崔巍巍，徐冰涵，于 婷，2，章培標(biāo)，劉 婭

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)第二醫(yī)院營養(yǎng)科，吉林長春 130041；3.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境高分子材料重點實驗室，吉林 長春 130022）

聚乙烯醇（PVA）是由聚醋酸乙烯酯水解獲得的一種水溶性高聚物，由其制備的水凝膠化學(xué)性質(zhì)不活潑、無毒，PVA良好的力學(xué)性能和對水分子等的透過性使其具有優(yōu)良的生物相容性，PVA良好的柔韌性及高彈性可降低其對周邊細(xì)胞和組織的機械刺激。因而，PVA水凝膠可作為創(chuàng)面敷料和緩釋藥物載體等［1－4］。二甲基砜（MSM）是人體膠原蛋白合成的必要物質(zhì)，不僅具有良好的鎮(zhèn)痛作用，還能促使傷口愈合、加強血液循環(huán)等，在醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用廣泛［5－7］。目前，有關(guān)將 MSM應(yīng)用在水凝膠敷料中的研究尚未見報道。本文作者將MSM溶解在PVA水溶液中，采用反復(fù)冷凍的物理交聯(lián)方法制備 MSM／PVA水凝膠，并評價其性能，探討MSM／PVA水凝膠作為人工敷料的可行性。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、實驗動物、試劑和主要設(shè)備 小鼠成纖維細(xì)胞L929，購于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心；豚鼠40只，體質(zhì)量（425±25）g，購于吉林大學(xué)實驗動物中心。PVA（SCRC國藥集團化學(xué)試劑有限公司）、MSM（遼寧省盤錦市磐石化工有限公司）、DMEM和新生牛血清（Gibco公司）、噻唑藍(lán)（MTT）和胰蛋白酶（Sigma公司）、二甲基亞砜（DMSO，Amresco公司）、多聚甲醛（永華特種化學(xué)試劑廠）、場發(fā)射環(huán)境電子顯微鏡（ESEM，Model XL30FEI，美國）、電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（ICP－OES，美國）、熒光倒置顯微鏡（TE2000－u，Nikon，日本）、電熱恒溫培養(yǎng)箱（DNP－9082，上海精宏實驗設(shè)備有限公司）、CO2培養(yǎng)箱（Heraeus BB5060UV，德國）、全自動酶標(biāo)儀（Thermo Multiskan－MK3，美國）。

1.2 MSM／PVA 水凝膠的制備［8］選擇濃度為12%的PVA水凝膠溶液，冷卻至室溫后，加入MSM水溶液，MSM在水凝膠中所占比例分別為0.01%、0.10%、1.00%和10.00%，混合均勻后靜止1h，除去氣泡，灌入無菌干燥的玻璃平皿中，室溫下靜止1h，－20℃冷凍12h，室溫解凍3h，如此反復(fù)循環(huán)3次，獲得含有不同比例MSM的MSM／PVA水凝膠。

1.3 ESEM觀察微觀結(jié)構(gòu) 將MSM／PVA水凝膠切割成1cm×1cm的方塊，室溫干燥后用真空抽干機去除材料中水分，使用液態(tài)CO2將材料脆斷，噴金后，在20kV條件下觀察微觀結(jié)構(gòu)。

1.4 脫水率測定 將 MSM／PVA水凝膠置于38℃恒溫培養(yǎng)，脫水干燥，分別于15、45、90、135、225、315和405min測定其脫水率，每組設(shè)置7個平行樣。脫水率（%）＝（1－ Wt／W0）×100%，W0為初始質(zhì)量，Wt為每個時間間隔水凝膠的質(zhì)量，直至恒質(zhì)量。

1.5 二次溶脹率測定 將等量干燥的MSM／PVA水凝膠放入蒸餾水中，38℃恒溫溶脹，分別于0.5、1.0、2.0、3.0和4.0h稱質(zhì)量，測定溶脹率，每組設(shè)置7個平行樣。溶脹率（%）＝（Mt－Md）／Md×100%，Md為干燥水凝膠的初始質(zhì)量，Mt為水凝膠t時刻的質(zhì)量。

1.6 水蒸氣透過率測定 將不同濃度的PVA水凝膠（8%、10%、12%和14%）及MSM／PVA水凝膠（0.01%、0.10%、1.00%和10.00%）切割成同樣薄厚的薄片，放于圓柱形裝有10mL蒸餾水的塑料杯杯口，杯口用密封帶密封好，將塑料杯放置于37℃干燥器中。按照6、12、24和48h的時間間隔，測定質(zhì)量損失的斜率，根據(jù)斜率計算出水蒸氣透過率。水蒸氣透過率（WVTR）（g·m－2·d－1）＝斜率×24／A，A為塑料杯口表面積。

1.7 電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP）測定MSM的損失量 將MSM／PVA水凝膠（MSM含量分別為 0.01%、0.10%、1.00%和10.00%）切 割 成5mg的材料塊，浸泡于PBS（pH7.2）中，密封后于37℃恒溫條件下釋放，分別于 0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、16.0、20.0和24.0h取出釋放液，采用ICP測定水凝膠及釋放液中MSM含量。

1.8 MTT法檢測MSM／PVA水凝膠浸提液的細(xì)胞毒性 將不同MSM含量的MSM／PVA水凝膠剪裁成0.5cm×2.0cm的長方形塊狀，置于無血清的DMEM培養(yǎng)基中，37℃浸提48h后，過濾除菌，4℃保存?zhèn)溆?。L929細(xì)胞以5×105mL－1接種于96孔板中，每孔100μL，加入浸提液，于37℃、5%CO2的條件下培養(yǎng)24h后，加入MTT溶液（5g·L－1），繼續(xù)孵育4h，棄上清，每孔加入150μL DMSO，振蕩溶解，于490nm波長處測定吸光度（A）值，計算細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率（%）＝（1－At）／A0×100%，At為實驗組A值，A0為對照組A值。以細(xì)胞增殖抑制率的均值評分標(biāo)準(zhǔn)評定受試物的毒性：細(xì)胞增殖抑制率在0～20%為0級，21%～40%為1級，41%～60%為2級，61%～80%為3級，81%～100%為4級［9］。

1.9 MSM／PVA水凝膠敷料對豚鼠皮膚燙傷的修復(fù)作用 將豚鼠去除背部被毛后，用恒溫電烙鐵灼傷6s，制備直徑為1cm的圓形燙傷。將豚鼠分為單 純 PVA、0.01%MSM／PVA、0.10%MSM／PVA、1.00%MSM／PVA、10.00%MSM／PVA水凝膠組及對照組，每組6只。對照組處理方法：用碘酒清洗創(chuàng)面以及周圍的皮膚，無菌紗布覆蓋創(chuàng)面，每日換1次。其他實驗組處理方法：用碘酒清洗創(chuàng)面以及周圍的皮膚，將無菌水凝膠覆蓋在創(chuàng)面上，每日換1次。分別于第7、15和30天采集皮膚組織樣品，多聚甲醛固定，石蠟切片，HE染色觀察組織學(xué)變化。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，脫水率、二次溶脹率、水蒸氣透過率、MSM含量、MSM釋放率及A值均以表示，組間比較采用t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 MSM／PVA水凝膠微觀結(jié)構(gòu) MSM／PVA水凝膠具有致密的多空孔結(jié)構(gòu)，電鏡結(jié)果表明：孔直徑大小為100～700nm，含有水分時，這些孔狀結(jié)構(gòu)能夠儲存水分，使水凝膠具有柔軟緊致的狀態(tài)。見圖1（插頁四）。

2.2 MSM／PVA水凝膠的脫水率 PVA組30、90、135、315和405min時脫水率為（15.70±1.59）%、（25.66±0.39）%、（40.83±1.38）%、（76.50±1.46）%和（91.72±0.91）%，0.01%MSM／PVA組為（15.91±0.52）%、（27.10±0.75）%、（41.87±3.06）%、（77.66±0.99）%和（91.90 ± 1.39）%；0.10%MSM／PVA組為（15.49±0.44）%、（26.15±0.66）%、（40.86±1.27）%、（76.96±0.72）%和（91.92±0.94）%；1.00%MSM／PVA組為（15.63±0.37）%、（25.51±1.26）%、（40.67±0.54）%、（76.88±0.91）%和（91.55 ± 0.24）%；10.00%MSM／PVA組為（15.45±1.19）%、（27.25±0.97）%、（40.91±1.07）%、（77.55±0.79）%和（91.64±0.77）%。同 一 時 間 內(nèi)，0.01% 、0.10% 、1.00%和10.00%MSM／PVA組脫水率與PVA組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；0.01%、0.10%、1.00%和10.00%MSM／PVA組脫水率組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.3 MSM／PVA水凝膠的二次溶脹率 隨著時間的延長，各組水凝膠的溶脹率逐漸增大，3h后，溶脹率升高至3倍。同一時間內(nèi)，0.01%、0.10%、1.00%和10.00%MSM／PVA組二次溶脹率與PVA組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；0.01% 、0.10% 、1.00%和10.00%MSM／PVA組二次溶脹率組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見表1。

表1 不同MSM含量MSM／PVA水凝膠的二次溶脹率Tab.1 Second swelling rates of MSM／PVA hydrogel with different MSM contents（n＝6，，η／%）

表1 不同MSM含量MSM／PVA水凝膠的二次溶脹率Tab.1 Second swelling rates of MSM／PVA hydrogel with different MSM contents（n＝6，，η／%）

72344.57±2.370.01%MSM 106.14±3.48162.00±1.15224.43±2.64282.57±2.64302.86±2.61312.86±3.63342.86±2.73341.00±3.560.10%MSM 106.71±3.30162.14±2.27225.14±2.89285.00±2.89305.57±1.51312.57±6.02341.00±1.73343.86±2.271.00%MSM 107.71±3.90163.00±2.16228.86±3.72283.86±3.72304.86±1.35316.86±2.41344.29±3.04345.00±3.3710.00%MSM 110.29±5.12165.43±2.07228.14±2.76281.57±2.76303.29±3.15314.57±3.603440.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 PVA 107.43±4.58162.14±2.73228.71±3.55284.57±3.55303.29±2.36314.29±1.50344.57±1.Group Second swellingrate（t／h）.29±1.60345.29±2.81

2.4 MSM／PVA水凝膠水蒸氣的透過率 PVA組6、12、24和48h時透過率為（0.590±0.022）、（1.800±0.045）、（2.600±0.031）和（5.290±0.023）g·m－2·d－1，0.01%MSM／PVA組為（0.570±0.037）、（1.190±0.046）、（2.590±0.026）和（5.220±0.039）g·m－2·d－1，0.10%MSM／PVA組為（0.590±0.028）、（1.210±0.038）、（2.610 ± 0.019）和（5.280 ±0.033）g·m－2·d－1，1.00%MSM／PVA組為（0.570±0.024）、（1.210±0.034）、（2.600±0.049）和（5.310±0.026）g·m－2·d－1，10.00%MSM／PVA組為（0.580±0.028）、（1.220±0.044）、（2.600 ± 0.025）和（5.280 ±0.029）g·m－2·d－1。同 一 時 間 內(nèi)，不 同 濃 度MSM／PVA組組間比較以及MSM／PVA各組與PVA組比較，水蒸氣透過率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.5 ICP測定 MSM 實際含量 0.01%、0.10%、1.00%和10.00%MSM／PVA水凝膠內(nèi) MSM實際含量 分 別 為（82.58±1.78）%、（84.38±1.15）%、（84.40±2.09）%和（85.94±0.94）%，均在80%以上，組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。

2.6 MSM／PVA水凝膠中MSM的釋放規(guī)律 隨著時間的延長，各組MSM／PVA水凝膠中的MSM緩慢釋放，且釋放量逐漸增多，24h后MSM累積釋放率達(dá)到55%以上，且釋放量趨于穩(wěn)定。同一時間內(nèi)，0.01% 、0.10% 、1.00%和10.00%MSM／PVA組釋放率組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）。見圖2。

圖2 MSM／PVA水凝膠中MSM釋放率Fig.2 Release rate of MSM in MSM／PVA hydrogel

2.7 MSM／PVA水凝膠浸提液作用后小鼠成纖維細(xì)胞L929的細(xì)胞增殖情況 PVA組A值（0.297±0.030）與對照組（0.338±0.010）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。0.01%MSM／PVA組（0.306±0.020）、0.10%MSM／PVA組（0.345±0.010）、1.00%MSM／PVA組（0.332±0.010）和10.00%MSM／PVA組（0.331±0.020）A 值分別與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；0.10%MSM／PVA組A值與PVA組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意 義（P＜0.05）。PVA、0.01%MSM／PVA、0.10%MSM／PVA、1.00%MSM／PVA、10.00%MSM／PVA組細(xì)胞增殖抑制率分別為12.32%、9.46%、－4.63%、1.87%和7.09%。PVA和MSM／PVA各組的毒性級別均為0級。

2.8 MSM／PVA水凝膠修復(fù)豚鼠燙傷皮膚的組織學(xué)觀察 燙傷部位表皮層組織缺失，真皮層毛囊結(jié)構(gòu)受到破壞，燙傷模型建立區(qū)域組織紅染較嚴(yán)重，且與周邊正常組織的藍(lán)染形成鮮明對比（圖3，見插頁四）。建模第7天各組豚鼠表皮結(jié)構(gòu)均嚴(yán)重缺失，真皮層組織結(jié)構(gòu)疏松，存在大量空泡狀結(jié)構(gòu)，膠原含量較少。第15天，對照組豚鼠表皮層缺失仍然嚴(yán)重，其他各組皆有較薄的表皮層出現(xiàn)，各組豚鼠真皮層毛囊結(jié)構(gòu)以及毛細(xì)血管仍然未出現(xiàn)，但部分纖維組織和結(jié)締組織已經(jīng)具有形成趨勢，組織結(jié)構(gòu)較為致密，創(chuàng)面肉芽組織灶形成，成纖維細(xì)胞增殖活躍，并分泌較細(xì)小的膠原纖維填充創(chuàng)面。第30天，各組豚鼠受創(chuàng)皮膚漸漸愈合，MSM／PVA各組豚鼠表皮細(xì)胞分化良好，真皮乳頭結(jié)構(gòu)明顯，真皮層成纖維細(xì)胞數(shù)量減少，膠原較粗大致密，排列整齊，但新生毛細(xì)血管依然少見。對照組及PVA組豚鼠表皮層出現(xiàn)分層結(jié)構(gòu)稍晚，上皮層較薄，基底層細(xì)胞平坦，同期所形成的真皮乳頭結(jié)構(gòu)不明顯。0.10%MSM／PVA組豚鼠愈合情況最好，1.00%和10.00%MSM組與對照組比較，也具有較好的促進創(chuàng)面愈合的能力（圖4～9，見插頁四）。

3 討 論

本文作者選取12%PVA水凝膠作為載體加入MSM，采用反復(fù)冷凍法制備水凝膠，使水凝膠具備良好的力學(xué)性能，隨著反復(fù)冷凍次數(shù)的增多，水凝膠的物理性能和機械性能不斷增強。MSM／PVA水凝膠的致密多空孔結(jié)構(gòu)使其具有柔軟緊致的狀態(tài)。MSM／PVA水凝膠脫水性能較好，MSM含量對MSM／PVA水凝膠的脫水率無顯著影響。MSM／PVA水凝膠具有較高的二次溶脹率，且MSM含量對MSM／PVA水凝膠的溶脹率無顯著影響。較高的溶脹率使MSM／PVA水凝膠在作為敷料使用時對傷口滲出液具有良好的吸收作用，有利于傷口愈合。MSM的緩慢釋放使得MSM／PVA水凝膠在作為敷料使用時對創(chuàng)面愈合有較好的輔助作用，MSM含量對MSM／PVA水凝膠的MSM釋放率無顯著影響。PVA水凝膠浸提液對小鼠成纖維細(xì)胞L929的增殖有顯著的抑制作用，不同MSM含量的MSM／PVA水凝膠浸提液對小鼠成纖維細(xì)胞L929的增殖無顯著影響。0.10%、1.00%和10.00%MSM組MSM／PVA水凝膠更有利于燙傷豚鼠創(chuàng)面的愈合。

綜上所述，以濃度為12%的PVA水凝膠為載體制備的MSM／PVA水凝膠表面微觀結(jié)構(gòu)、脫水性、溶脹性和MSM 釋放性能較好，0.10%和1.00% 的 MSM／PVA水凝膠綜合狀況良好。因此，MSM／PVA水凝膠可作為優(yōu)良的人工敷料，對皮膚燙傷修復(fù)有促進作用。

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