核酸恒溫擴增－免疫層析技術(shù)在布魯菌病診斷中的應(yīng)用

張慧慧，劉凡瑜，姚 燕，陳澤良，孫樺楠，甄 清

（1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)教研室，吉林 長春 130021；2.解放軍軍事研究院疾病控制所，北京 100071；3.吉林省動物疫病預(yù)防控制中心，吉林 長春 130062）

布魯菌?。ú疾。┦怯刹剪斁秩霗C體而引起傳染－變態(tài)反應(yīng)的人畜共患傳染病。分離培養(yǎng)、免疫學(xué)和PCR等方法都可以作為布病患者的實驗室檢測診斷手段，但不同方法的結(jié)果并不完全擬合，迄今為止，分離培養(yǎng)仍是確診布病的最可靠證據(jù)［1］。由于病原分離培養(yǎng)方法存在生物安全問題，培養(yǎng)需要幾天至幾周時間［2］，普通實驗室不能開展，因此目前實驗室仍應(yīng)用基于抗原抗體的免疫學(xué)檢測方法，如試管凝集試驗（SAT）。SAT操作簡便，易于判定，我國將其列為動物布病診斷的國家標(biāo)準［3］。但由于抗體的檢測方法存在空窗期，即抗體未產(chǎn)生或未達到診斷標(biāo)準前，往往造成漏診，因此替代分離培養(yǎng)及抗原抗體的免疫學(xué)檢測方法的其他實驗室檢測方法是近期研究的熱點。核酸恒溫擴增方法采用交叉引物的恒溫擴增，在擴增中引入標(biāo)記探針，結(jié)合對擴增產(chǎn)物的免疫層析檢測技術(shù)，實現(xiàn)了對目標(biāo)核酸分子的高敏感度和高特異度檢測［4］。其突出特點是操作簡便，結(jié)合免疫層析檢測裝置，肉眼可直接進行結(jié)果判定，不需特殊儀器。若能將該方法在布病實驗室診斷和流行病現(xiàn)場篩查中推廣應(yīng)用，對于降低人畜布病漏診率具有重要意義［5］。本研究以布病門診就診者的全血為樣本進行檢測，

與免疫學(xué)指標(biāo)進行對比，對不同病期就診者的檢出率進行分析，同時結(jié)合就診者臨床背景資料以及流行病學(xué)接觸史加以分析，了解該檢測方法在不同臨床就診者中的診斷意義和應(yīng)用價值，為核酸檢測標(biāo)準化推廣應(yīng)用提供實驗室參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選擇2012年2—8月在吉林省松原市疾病預(yù)防控制中心布病門診就診且有布病臨床表現(xiàn)及流行病學(xué)接觸史的就診者190人，收集就診者的抗凝全血（以枸櫞酸鹽為抗凝劑）；非抗凝血4℃過夜分離血清。結(jié)合實驗室SAT檢測結(jié)果將研究對象劃分為：SAT≥1∶50為陽性就診者115人，SAT＜1∶50為陰性就診者75人。

1.2 主要試劑及儀器 紅細胞裂解液：55g蔗糖、1moL·L－1的 MgCl22.5mL、5mL Triton X－100及5mLTris－HCl，ddH2O定容至500mL，高壓滅菌。Triton X－100購自美國Sigma公司；PBS購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司；布魯氏菌恒溫擴增核酸試紙條檢測試劑盒購自杭州優(yōu)思達生物技術(shù)有限公司；一次性核酸檢測裝置購自杭州優(yōu)思達生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計 布魯氏菌恒溫擴增核酸試紙條檢測試劑盒（杭州優(yōu)思達生物技術(shù)有限公司）針對布魯氏菌0BMEI0536基因序列設(shè)計了2對特異性引物（F3／B3和F2／PR）和1對特異性探針（5F／5B），引物序列如表1。

表1 恒溫擴增引物Tab.1 Primers of isothermal amplification

1.4 樣本核酸提取方法 ①血液樣本的核酸提取：取0.3mL抗凝全血，加等量紅細胞裂解液，充分混勻后室溫靜置10min，12000r·min－1離心2min，棄上清；向沉淀中加入PBS 1.0mL，重懸沉淀。12000r·min－1再離心2min，棄上清。加500μL 2%Triton X－100，重懸沉淀，室溫靜置5min，12000r·min－1離心2min，棄上清，加入ddH2O 30～50μL；封口膜封口，沸水浴10min。12000r·min－1離心5min，上清即為模板。②血清樣本的核酸提?。?0μL血清與檢測試劑盒中等量DNA提取液充分混勻，沸水浴10min，4℃靜止10min，12000r·min－1離心5min，吸取上清至清潔離心管，即為血清樣本的布魯氏桿菌模板。

1.5 核酸恒溫擴增 確定反應(yīng)液的管數(shù)，進行標(biāo)記；反應(yīng)液管4000r·min－1，離心3～5s；在反應(yīng)液管中直接加入10μL ddH2O，作為陰性對照；在剩余的反應(yīng)液管中各加入6μL ddH2O，然后分別加入4μL處理好的待測樣本或陽性對照；將反應(yīng)管瞬時離心；60℃、60min水浴擴增。

1.6 恒溫擴增－免疫層析裝置操作方法 將經(jīng)過擴增的反應(yīng)管（不可開蓋，以避免污染）放置在裝置固定盒中，用力壓下，15min后可通過閱讀窗判讀結(jié)果，陽性、陰性對照成立的情況下即可觀察和記錄樣本檢測結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，配對設(shè)計2組頻數(shù)分布采用配對校正χ2檢驗，a＝0.05；核酸恒溫擴增－免疫層析檢測法與SAT檢測法的符合率采用篩檢實驗分析。

2 結(jié) 果

2.1 29例就診者的全血和血清分別作為樣本提取核酸結(jié)果比較 190例就診中采集到29例就診者的全血和血清，應(yīng)用核酸恒溫擴增－免疫層析方法檢測29例就診者的全血和血清，以全血為樣本核酸擴增陽性率為55.2%（16／29），以血清為樣本核酸擴增陽性率為23.1%（6／29），經(jīng)配對χ2分析χ2校正＝8.1，P＜0.05，表明全血和血清作為布魯菌核酸提取樣本的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。全血作為布魯菌核酸提取樣本的敏感性優(yōu)于血清。見表2。

表2 29例就診者全血和血清樣本核酸恒溫擴增－免疫層析檢測結(jié)果Tab.2 The results of nucleic acid isothermal amplification-immunochromatographic test of blood and serum samples of 29cases

2.2 190例就診者核酸恒溫擴增檢測法與SAT檢測法符合率分析 190例不同病程就診者應(yīng)用SAT檢測，115例為SAT≥1∶50的陽性就診者，75例為SAT＜1∶50的陰性就診者。對190例就診者均以全血作為核酸提取樣本，并進行核酸恒溫擴增－免疫層析檢測，檢測結(jié)果與SAT檢測結(jié)果比較見表3，2種檢測方法的符合率為57.9%。

2.3 93例首次就診急性早期布病患者核酸恒溫擴增檢測法與SAT檢測法符合率分析 93例首次門診就診的急性早期布病患者（病程在3個月內(nèi)）的SAT檢測，61例SAT≥1∶50的陽性就診者，32例SAT＜1∶50的陰性就診者，93例就診者均以全血作為核酸提取樣本，并進行核酸恒溫擴增－免疫層析檢測，檢測結(jié)果與SAT檢測結(jié)果比較見表4，2種檢測方法符合率為63.4%。

表3 190例就診者SAT和核酸恒溫擴增檢測結(jié)果分布Tab.3 The distribution of SAT and isothermal amplification test results of 190cases

表4 93例首次就診的急性早期布病患者SAT和核酸恒溫擴增檢測結(jié)果分布Tab.4 The distribution of SAT and isothermal amplification test results of 93patients with acute early brucellosis seeing the doctor at the first time

3 討 論

分離培養(yǎng)作為布病實驗室診斷的金標(biāo)準，在本次臨床樣本驗證中尚未分離出布魯菌，在以后的實驗中將繼續(xù)進行臨床樣本分離。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展及其在人畜共患病領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，特別是對于難于培養(yǎng)和培養(yǎng)時間長以及存在生物安全問題的病原體的檢測具有重要意義，基于核酸擴增方法已應(yīng)用于布病的輔助診斷［6］。近年來，國內(nèi)外已將該法應(yīng)用于細菌性疾病、病毒性疾病和寄生蟲病等多種動物疫?。?－8］的檢測方面，但由于該方法缺乏標(biāo)準化，而未能得到推廣應(yīng)用。本研究中核酸恒溫擴增－免疫層析檢測法不需要變性過程，擴增效率也得到提升，理論上檢測敏感性為PCR方法的10～100倍［9］，擴增微量DNA有效地檢測出布魯菌，對早期感染的檢測比免疫學(xué)檢測方法更靈敏［10］。且實驗所設(shè)計引物為多對，具有較高敏感性，有研究［11］已對引物序列擴增的核酸片段進行測序，并與常見的其他病菌核酸進行過交叉擴增實驗，未出現(xiàn)交叉擴增，具有較高的特異度。

據(jù)文獻報道：在全血或血清作為核酸提取樣本方面不是所有的研究均得到一致的結(jié)論。Zerva等［12］使用血清和全血樣本檢測了31例布病患者，血清檢出率為61%，而全血檢出率為94%。Vrioni等［13］檢測血清樣本的陽性率為17.7%，而全血為20.2%。本研究全血作為樣本提取核酸進行恒溫擴增陽性率較血清作為樣本提取核酸進行恒溫擴增陽性率高，與Zerva等報道結(jié)果一致。

在提取核酸方法方面，布魯氏菌恒溫擴增核酸試紙條檢測試劑盒提倡用血清，血清中PCR抑制因子少，用量少，核酸提取過程簡單，但重復(fù)檢測出現(xiàn)假陰性，可能是由于核酸在血清中的含量少、易被破壞、分布不均等，或樣本例數(shù)少影響檢測敏感性所致。而血液提取核酸過程處理相對復(fù)雜，易受血液中其他成分干擾，操作中裂解是否充分，血紅蛋白去除效果等均可能會影響檢測結(jié)果，重復(fù)測量某些樣本出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。但血液中提取核酸用量大、含量高，提高就診者的核酸發(fā)現(xiàn)率。

王麗等［14］對不同病程布病患者的98份全血樣本進行PCR檢測，僅有2份全血出現(xiàn)微弱陽性，陽性率僅為14.3%，不能有效地鑒別診斷布病。核酸恒溫擴增－免疫層析檢測方法在普通PCR基礎(chǔ)上進行改進后對190份全血樣本進行檢測，與免疫學(xué)檢測法SAT的符合率為57.9%，對鑒別診斷布病患者和非患者無參考價值，這一結(jié)果與其他基于核酸檢測的報道一致。

國外學(xué)者［15］認為：核酸恒溫擴增在急性早期和治療后的隨訪有較高的臨床應(yīng)用價值，對93例首次就診急性早期布病患者的全血進行核酸恒溫擴增－免疫層析檢測，與免疫學(xué)檢測法SAT的符合率為63.4%，驗證了其在急性早期布病的臨床應(yīng)用價值；為急性早期布病患者在抗體滴度尚未產(chǎn)生或未達到診斷標(biāo)準時提供實驗室參考及治療依據(jù)，避免因漏診而錯過最佳治療時期，如果轉(zhuǎn)為慢性期，將導(dǎo)致疾病遷延不愈。由于布病病程長短不一，核酸恒溫擴增在首次就診發(fā)病3個月內(nèi)的就診者中應(yīng)用的特異度較低，假陽性率高，建議追蹤隨訪首次就診SAT檢測陰性者，監(jiān)測其在潛伏期內(nèi)是否會轉(zhuǎn)變?yōu)榛颊?，降低假陽性率。增加樣本量，進一步驗證核酸恒溫擴增檢測在急性早期布病及治療后隨訪中的臨床應(yīng)用價值。

綜上所述，雖然目前用于布病的診斷方法很多，但均有一定的局限性，尚未有一種方法能適合所有情況布病的檢測診斷，各種技術(shù)不能互相代替，綜合多種檢測方法并結(jié)合就診者臨床背景資料以及流行病學(xué)接觸史加以分析，才能減少漏診的發(fā)生。本實驗所建立的核酸恒溫擴增－免疫層析法，擴增過程不需要溫度循環(huán)，因此不會受到雙鏈DNA的污染，將核酸擴增試劑研制成試劑盒，并與免疫層析技術(shù)相結(jié)合研制出直接判讀結(jié)果的裝置，推進了標(biāo)準化檢測，簡化了操作步驟，降低了操作過程中的危險，而且有效減少了漏診的發(fā)生。

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