楨楠愈傷組織誘導(dǎo)初探

魏歡平，李 翠，羅 罡，賀筱蓉

(浙江外國(guó)語(yǔ)學(xué)院科學(xué)技術(shù)學(xué)院，浙江杭州310012)

1 引言

楨楠(Phoebe zhennan S.Lee et F.N.Wei)為樟科楠屬大喬木，高達(dá)30余米，樹干通直，為我國(guó)特有，是國(guó)家二級(jí)保護(hù)物種［1］.楨楠耐腐蝕性強(qiáng)，埋在地里幾千年不腐爛，并且具有幽香，在光照下發(fā)出絲絲金光，故被稱作金絲楠木.楨楠又名楠木、金絲楠、湖南楠、雅楠、光葉楠、巴楠、細(xì)葉潤(rùn)楠和小葉楠［2］.如楊家駒在《楨楠的研究與鑒別》［3］中所言，楨楠木是國(guó)人引以自豪的瑰寶，它也使庭院建筑的中國(guó)風(fēng)味更濃.

楨楠自然生長(zhǎng)和人工栽培十分緩慢，適生生境少，成材率低，因此價(jià)格不斷上升，產(chǎn)品供不應(yīng)求.為了實(shí)現(xiàn)楨楠資源的可持續(xù)利用，科學(xué)家近幾年開始了人工栽培技術(shù)研究工作，但直到現(xiàn)在，雖然保護(hù)工作比較到位，但種子生產(chǎn)、組織培養(yǎng)和設(shè)施栽培等人工繁育關(guān)鍵技術(shù)還不夠完善［4］.楨楠幼苗栽培技術(shù)雖然取得一些進(jìn)步，但在組織培養(yǎng)上仍存在技術(shù)難度大、投資成本高、風(fēng)險(xiǎn)大等問(wèn)題.基于此，我們希望通過(guò)對(duì)楨楠葉子和嫩莖誘導(dǎo)形成愈傷組織，為進(jìn)一步提高楨楠人工載培技術(shù)水平提供參考和依據(jù).

2 材料與方法

本實(shí)驗(yàn)采用的楨楠植株來(lái)自四川省峨眉山，外植體取帶葉芽的莖段和葉.

2.1 外植體消毒處理方法

參考劉雪紅等的方法，實(shí)驗(yàn)者將選取好的外植體用自來(lái)水沖洗，然后用濃度為5%的洗衣粉水溶液漂洗5min，再用自來(lái)水沖洗30min，接著用濃度為75%的乙醇擦洗表面，再接著用0.1%升汞溶液消毒8min后，再用無(wú)菌水沖洗4～6次，用無(wú)菌吸水紙吸干水分.最后在無(wú)菌工作臺(tái)中將外植體切成約1.0cm長(zhǎng)的小段，將葉切成約1.0×1.0cm2小塊，分別接種到各種愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上.葉片正接(上表皮朝上)，莖段橫接(水平放置)，每瓶接種1個(gè)外植體，每種配方接種20瓶［5］.

2.2 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件

本實(shí)驗(yàn)以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別添加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、2.4-D和NAA，具體方案見表1.pH值調(diào)節(jié)為5.8～6.0，培養(yǎng)溫度為(25±2)℃，每天光照時(shí)間為12 h，光照強(qiáng)度為1700 lx.接種70d后觀察統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)情況.

表1 不同激素配比方案對(duì)比

3 結(jié)果與分析

3.1 不同配比的激素誘導(dǎo)葉形成愈傷組織的比較

以楨楠葉為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA、2.4-D和NAA，經(jīng)過(guò)70d的培養(yǎng)后，對(duì)所形成的愈傷組織進(jìn)行比較，結(jié)果見表2.

表2 不同激素配比對(duì)楨楠葉誘導(dǎo)愈傷組織的影響

由表2可知，在4個(gè)不同激素配比的配方中，培養(yǎng)70d，Ⅳ的愈傷組織形成情況好于其余3個(gè)配方.此外，Ⅳ誘導(dǎo)愈傷組織較快，而且誘導(dǎo)的愈傷組織大，長(zhǎng)勢(shì)好;Ⅰ誘導(dǎo)愈傷組織較慢，且誘導(dǎo)的愈傷組織較小;Ⅱ、Ⅲ愈傷組織誘導(dǎo)情況介于I和Ⅳ之間.可見，當(dāng)以葉為外植體時(shí)，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+2.0mg/L NAA+2.0mg/L 6－BA.

3.2 不同配比的激素誘導(dǎo)帶葉芽的莖段形成愈傷組織的比較

以帶葉芽的莖段為外植體，以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6－BA、2.4－D和NAA，經(jīng)過(guò)70d的培養(yǎng)后，對(duì)所形成的愈傷組織進(jìn)行比較，結(jié)果見表3.

表3 不同激素配比對(duì)楨楠帶葉芽的莖段誘導(dǎo)愈傷組織的影響

由表3可知，在4個(gè)不同激素配比的配方中，培養(yǎng)70d，對(duì)于帶葉芽的莖段而言，Ⅳ的愈傷組織形成情況好于其余3個(gè)配方.此外，Ⅳ誘導(dǎo)愈傷組織較快，而且誘導(dǎo)的愈傷組織大，長(zhǎng)勢(shì)好;Ⅰ誘導(dǎo)愈傷組織較慢，且誘導(dǎo)的愈傷組織較小;Ⅱ、Ⅲ愈傷組織誘導(dǎo)情況介于I和Ⅳ之間.可見，當(dāng)以帶葉芽的莖段為外植體時(shí)，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為:MS+2.0mg/L NAA+2.0mg/L 6－BA.

3.3 同種激素對(duì)楨楠莖和葉外植體誘導(dǎo)形成的愈傷組織比較

以葉和帶葉芽的莖段為外植體，在編號(hào)為Ⅳ最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方中誘導(dǎo)形成的愈傷組織進(jìn)行比較，結(jié)果見表4.

表4 同種激素配比對(duì)楨楠莖和葉外植體誘導(dǎo)形成的愈傷組織的影響

由表4可知，當(dāng)激素配比相同時(shí)，以楨楠植株葉和帶葉芽的莖段作為外植體誘導(dǎo)，以葉為外植體開始形成愈傷組織的時(shí)間約在25d至30d，而以帶葉芽的莖段為外植體開始形成愈傷組織的時(shí)間超過(guò)40d，說(shuō)明以葉為外植體開始形成愈傷組織的速度比以帶葉芽的莖段為外植體開始形成愈傷組織的速度快.經(jīng)過(guò)70d誘導(dǎo)培養(yǎng)，以葉和以帶葉芽的莖段作為外植體形成愈傷組織的平均重量分別為2.058g和1.223g，表明以葉為外植體形成愈傷組織在重量上明顯具有優(yōu)勢(shì).同時(shí)以葉作為外植體誘導(dǎo)形成的愈傷組織具有顏色偏綠、質(zhì)地緊密、褐化少的特點(diǎn);而以帶葉芽的莖段誘導(dǎo)形成的愈傷組織顏色深，褐化嚴(yán)重.

3.4 楨楠愈傷組織的增殖培養(yǎng)

增殖培養(yǎng)是將誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織等培養(yǎng)物反復(fù)多次重新分割、移植到新鮮培養(yǎng)基或其它培養(yǎng)基上進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)的過(guò)程.該過(guò)程是植物組織培養(yǎng)快速繁殖中決定繁殖速度快慢、繁殖系數(shù)高低的關(guān)鍵階段.將誘導(dǎo)形成的楨楠愈傷組織轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，結(jié)果表明由葉誘導(dǎo)形成的愈傷組織在繼代培養(yǎng)中具有增殖能力;而由帶葉芽的莖段誘導(dǎo)形成的愈傷組織顏色深、褐化嚴(yán)重，在繼代培養(yǎng)過(guò)程中增殖能力較差.

4 結(jié)論與討論

從理論上講，植物細(xì)胞都具有全能性，能夠再生新植株，任何器官、任何組織、單個(gè)細(xì)胞和原生質(zhì)體都可以作為外植體.但實(shí)際上，不同品種、不同器官之間的分化能力有巨大差異，培養(yǎng)的難易程度不同.為保證植物組織培養(yǎng)獲得成功，選擇合適的外植體是非常重要的［6］.例如在歐少云等對(duì)清遠(yuǎn)筆架茶的愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，嫩葉是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳材料［7］.在實(shí)驗(yàn)研究比較中，在大部分情況下莖是最佳外植體材料，例如在高明波等對(duì)東北紅豆杉的愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，莖是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳材料［8］;談凱等對(duì)日本紅楓的愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，嫩莖是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳材料［9］;王曉娟等對(duì)大花萱草的愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，莖尖是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳材料［10］.陳怡平等對(duì)紫斑牡丹的愈傷組織誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)中，幼芽是誘導(dǎo)愈傷組織的最佳材料［11］.根據(jù)現(xiàn)有的材料條件，我們選擇了楨楠的葉和部分帶葉芽的莖段，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:葉作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)，愈傷組織形成情況較好;而帶葉芽的莖段誘導(dǎo)形成的愈傷組織顏色深，褐化嚴(yán)重，繼代培養(yǎng)過(guò)程中，愈傷組織增殖能力差.這可能是因?yàn)槲覀內(nèi)〔臅r(shí)間是11月下旬，楨楠植物正處于生長(zhǎng)末期或休眠期，不利于愈傷組織的誘導(dǎo).

實(shí)驗(yàn)成果對(duì)今后楨楠在組培過(guò)程中誘導(dǎo)和增殖培養(yǎng)基的選擇，以及培養(yǎng)環(huán)境的控制方面起到一定參考作用，可為其他培育機(jī)構(gòu)開展大規(guī)模繁殖提供基礎(chǔ)性的幫助.

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