超高效液相色譜－串聯(lián)質譜測定污泥中氯霉素、磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類與大環(huán)內酯類抗生素

王 碩，張 晶，邵 兵*

(1.北京市朝陽區(qū)疾病預防控制中心，北京 100021;2.北京市疾病預防控制中心，食物中毒診斷溯源技術北京市重點實驗室，北京 100013)

近年來，藥品和個人護理品(PPCPs)作為環(huán)境新型污染物受到了廣泛關注。藥品中的抗生素主要用于預防和治療細菌感染性疾病。據報道，僅2005年，我國生產約21萬噸抗生素，其中9萬噸作為獸藥使用［1］。這些藥物使用后，經動物排泄、廢水處理等不同途徑進入環(huán)境，從而可能引發(fā)細菌耐藥性等一系列問題。目前在飲用水［2－3］、生活污水［4－5］、土壤、河流底泥和污泥［6－9］等多種環(huán)境中均檢出了抗生素類藥物殘留。由于市政污水處理廠被認為是多種污染物消除的主要場所，且部分藥物親脂性較強，易在污泥體系中富集，因此，污泥中抗生素類藥物的檢出濃度可高達mg/kg級［7，10－11］，給污泥堆肥、資源化使用和無害化處置帶來了挑戰(zhàn)。為了解污泥中多種抗生素的存在水平和污染現(xiàn)狀，有必要建立一種同時測定污泥中多種抗生素藥物的分析方法，以進行實際樣品的監(jiān)測。

本文選取50種常用的抗生素為研究對象，包括6種四環(huán)素、16種喹諾酮、20種磺胺類、7種大環(huán)內酯類藥物以及氯霉素。由于污泥基質復雜，目標藥物種類多且理化性質差異大，為了減少物質干擾、提高提取效率，樣品的提取和凈化步驟非常關鍵。對于污泥中藥物等痕量污染物的提取，常用的技術有超聲提取(USE)［8，11－14］和加速溶劑萃取(ASE)［6－7，10，15－16］。本實驗比較了 USE 和 ASE 法對污泥中 50種目標藥物的提取效果。HLB小柱是兼具親脂和親水基團的反相柱，可同時富集不同極性的物質，常用于復雜基質中多種目標化合物的同時富集。但對于污泥基質來說，單一的HLB小柱不能較好地去除天然有機質(如腐植酸等)的干擾，從而影響檢測結果的靈敏度和特異性［17］。本實驗使用HLB串聯(lián)NH2柱富集凈化，結合超高效液相色譜－串聯(lián)質譜(UPLC－ESI－MS/MS)技術，建立了污泥中多種抗生素的檢測方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

ACQUITYTM超高效液相色譜儀、Micromass－Quattro UltimaTMPt質譜儀(Waters公司)，AllegraTMX－22R型離心機(Beckman公司)，超聲波清洗器(美國Cole－Parmer公司)，Oasis HLB固相萃取柱(6 mL/150 mg)、NH2固相萃取柱(6 mL/500 mg，Waters公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，F(xiàn)isher Scientific)，甲酸(純度為99%，Acros Organics)，氨水、鹽酸(優(yōu)級純，北京化學試劑公司)，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA－Na2，分析純，北京化學試劑公司);實驗室用水均為超純水，電阻率為18.2 MΩ·cm(Millipore超純水機制備)。

6種四環(huán)素類和16種喹諾酮類藥物購自Sigma公司(St.Louis，MO，USA)，20種磺胺類、7種大環(huán)內酯類藥物和氯霉素購自Dr.Ehrenstorfer公司(Augsburg，Germany)，純度均高于97%。藥物名稱見表1。

1.2 標準溶液配制

以甲醇為溶劑分別配制質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液，于－18℃保存。臨用時用5%甲醇水溶液稀釋上述標準儲備溶液，配制成不同濃度的標準工作液。

1.3 樣品采集

污泥樣品于2010年5月采自北京某污水處理廠?；钚晕勰鄰钠貧獬刂胁杉?，剩余污泥為壓濾后的污泥。將不同的污泥樣品分別濃縮、冷凍干燥后，于研缽中磨碎并混合均勻，轉移至密閉玻璃瓶中于－20℃保存。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取準確稱取0.5 g污泥，置于50 mL離心管中。加入10 mL乙腈－水(25∶75)溶液(用氨水調節(jié)至pH 10.0)，渦旋1 min，超聲提取15 min后，4℃離心10 min(10 000 r/min)。取出上清液，殘渣再加入10 mL提取溶液。重復上述步驟。合并提取液，用水稀釋至200 mL。實驗考察了ASE的提取效率，稱取0.5 g污泥和2.0 g硅藻土充分混勻，全部轉移至萃取池中。選取不同的提取溶劑進行提取效率的比較。提取參數:壓力1 500 psi，溫度100℃，加熱時間5 min，靜態(tài)萃取時間5 min，循環(huán)次數3次。轉出提取液用水稀釋至200 mL。

1.4.2 凈化向稀釋液中加入0.5 g EDTA－Na2，用鹽酸調節(jié)稀釋液pH值至3.0。將稀釋液全部過HLB小柱(活化:6 mL甲醇、6 mL 5%pH 3.0的EDTA－Na2水溶液)，上樣完畢后，用5 mL水淋洗。再用5 mL甲醇溶液洗脫，洗脫液流經NH2柱(活化:6 mL丙酮)，分別用6 mL丙酮－甲醇－甲酸(500∶500∶1)溶液和6 mL丙酮－甲酸(1 000∶1)溶液洗脫。收集洗脫液于微弱的氮氣流下吹干，用1 mL 5%甲醇水溶液溶解，渦旋1 min，轉至2 mL樣品瓶中，用于UPLC－MS/MS測定。

1.5 LC－MS/MS測定

1.5.1 色譜條件 色譜柱:Waters ACQUITY UPLCTMBEH C18柱(100 mm×2.1 mm i.d.，1.7 μm，Waters，USA)，柱溫:40℃，樣品溫度:10℃，進樣體積:10 μL，流速為0.3 mL/min。

正離子模式:流動相:A為0.1%甲酸的水，B為甲醇;梯度洗脫程序:0～3 min，5%～20%B;3～4 min，20%～30%B;4～8 min，30%～35%B;8～12 min，35%～70%B;12～15 min，70%～100%B;16～16.1 min，100%～5%B;保持3 min。

負離子模式:流動相:A為水，B為乙腈，梯度洗脫程序:0～2 min，5%～45%B;2～5 min，45%～65%B;5～5.1 min，65%～100%B;5.6～5.7 min，100%～5%B;保持3 min。

1.5.2 質譜條件 離子源:電噴霧電離ESI(+)和電噴霧電離ESI(－);毛細管電壓:3.0 kV(ESI+)和2.8 kV(ESI－);錐孔電壓:60 V;射頻透鏡1(RF Lens1)和射頻透鏡2(RF Lens2)電壓分別為25 V和1 V;離子源溫度:100℃;脫溶劑氣溫度:350℃;脫溶劑氣流量:600 L/min;碰撞室電壓:3.4×10－3mbar;50種藥物的多反應監(jiān)測(MRM)參數見文獻［5］和［18］。

2 結果與討論

2.1 前處理條件優(yōu)化

由于50種目標藥物的理化性質差異較大，因此，在優(yōu)化提取溶液時，使用加標污泥樣品比較了不同pH值、不同比例的甲醇－水和乙腈－水，以及USE和ASE兩種提取方式的提取效率。結果表明，使用不同比例及組分的提取溶液時，兩種提取方式對磺胺類和喹諾酮類藥物的提取效率相似;對于四環(huán)素類、大環(huán)內酯類和氯霉素，USE的提取效率分別為38.2%～77.7%、37.1%～87.4%和40.6%～70.1%;而ASE提取方式只從污泥中提取出泰樂菌素、紅霉素和麥迪霉素，提取效率也明顯低于USE。這可能是由于四環(huán)素類藥物比磺胺類藥物的熱解析溫度低［19－20］，使用ASE時，溫度不能同時滿足這幾類藥物的要求。

采用USE提取，提取液為pH 10.0乙腈－水(25∶75)溶液時，污泥樣品中的50種抗生素可以全部提取出來，磺胺類的提取效率為46.1%～69.6%，喹諾酮類為43.1%～70.2%，四環(huán)素類為41.9%～71.9%，大環(huán)內酯類為65.2%～87.4%，氯霉素為70.1%。明顯高于其它提取條件下的提取效率。其原因可能是由于藥物在土壤表面的吸附機理包括離子鍵作用和氫鍵作用［21－23］。提高提取溶液的pH值可破壞氫鍵，從而使藥物與污泥解離;且在堿性溶液中，喹諾酮類藥物結構中的羧基帶負電，與活性污泥的負電性表面排斥而達到解離的效果［21］。因此，在堿性條件下的提取效果較好。

2.2 固相萃取條件優(yōu)化

污泥中的天然有機質(如腐植酸等)含量較高，在液相色譜－質譜分析過程中，會產生基質抑制，造成被測化合物的靈敏度降低。因此，本文采用固相萃取技術對提取液中的目標藥物進行富集凈化?；谀繕怂幬锏臉O性和酸堿性差異大，本實驗比較了HLB柱、MAX柱和C18Sep－Pak柱的富集效果。將提取液稀釋至200 mL，加入0.5 g EDTA－Na2并用鹽酸調至pH 3.0后，藥物在酸性條件下保持非解離狀態(tài)，其經過HLB柱時可以得到較好的保留［24］;其它兩種固相萃取柱的上樣液均為稀釋200 mL的提取液。實驗結果表明:藥物經過HLB柱后的絕對回收率均高于40%，而MAX柱和C18Sep－Pak柱分別只有24種和29種藥物的絕對回收率高于40%。因此，選用HLB柱對污泥樣品進行富集。

提取液經HLB富集后，其顏色較為渾濁，基質抑制作用明顯，這可能是由于HLB柱不僅吸附目標藥物也吸附大量干擾物。當用甲醇洗脫時，由于甲醇的洗脫能力很強，抗生素和干擾物同時被洗出［25］。因此，需對樣品凈化，本實驗選用對腐植酸類雜質凈化能力較強的NH2柱。結果表明使用NH2柱凈化后，樣品提取液顏色澄清，基質抑制率減小為8.6%～25.0%。因此，HLB柱串聯(lián)NH2柱對污泥樣品具有較好的富集凈化效果。

2.3 方法學確證

2.3.1 標準工作曲線 50種藥物使用外標法定量，配制基質匹配系列標準工作曲線。結果顯示，氯霉素標準工作曲線的質量濃度為1.00～160 μg/L;磺胺類和喹諾酮類藥物混合標準工作曲線的質量濃度為0.50～100 μg/L;四環(huán)素類和大環(huán)內酯類藥物混合標準工作曲線的質量濃度為5.00～400 μg/L，在相應質量濃度范圍內，其線性相關系數均大于0.99。

2.3.2 方法檢出限 以能夠產生峰對峰信噪比S/N=3和S/N=10對應的藥物濃度分別定義為方法檢出限(MDL)與方法定量下限(MQL)，對于污泥樣品中未檢出的藥物，以基質加標的方法，通過低濃度加標水平的檢測結果進行計算。獲得目標化合物的MDL為0.03～1.67 μg/kg，MQL為0.10～5.00 μg/kg(見表1)。與已有的文獻相比，本方法的檢出限處于較低或相當的水平［7－8，16］。

2.3.3 準確度與精密度 用污泥樣品進行加標回收實驗，設低、中、高3個加標濃度，每個濃度設6個平行。其中低濃度以S0表示，中濃度和高濃度分別為5S0和50S0。S0對應的SDZ、SIM、SMR、SDX、SML、SDM和CAP的濃度為1.0 μg/kg，SMT、SCP、STZ及6種四環(huán)素類藥物和7種大環(huán)內酯類藥物的濃度為5.0 μg/kg，其它11種磺胺和16種喹諾酮類藥物的濃度為2.0 μg/kg。由于污泥樣品中含有某些抗生素，且含量較高，因此對這些抗生素的加標回收實驗采用花泥代替，結果見表1。50種目標化合物的平均回收率為40%～111%，相對標準偏差(RSD)為2.9%～27.1%，說明該方法具有較好的回收率和重現(xiàn)性。

表1 污泥中50種抗生素類藥物的回收率(n=6)、相對標準偏差及定量下限Table 1 Recoveries(n=6)，relative standard deviations(RSDs)and MQLs of the antibiotics in sludges

(續(xù)表1)

2.4 方法應用

應用本方法對北京某污水處理廠采集的6份活性污泥樣品和24份剩余污泥樣品進行檢測，結果見表2，共有14種藥物檢出，包括3種磺胺類SDZ、SPD和SMX，9種喹諾酮類OFX、NOR、CIP、LOM、ENO、PPA、PEF、ENR和SPA，以及OTC和AZI。其中，磺胺類藥物SDZ、SPD和SMX在活性污泥中的濃度水平為39.9～151.1 μg/kg，顯著高于剩余污泥中的濃度(4.0～130.2 μg/kg)，這可能是由于藥物在污泥處理過程中產生降解所致。喹諾酮類藥物中NOR、OFX和CIP的檢出濃度較高，為57.0～442.5 μg/kg。本實驗的檢測結果高于或接近其他國家的報道，包括日本(NOR:54～87 μg/kg，CIP:17～243 μg/kg)［13］和愛沙尼亞(NOR:20.8 ～20.5 μg/kg，OFX:4.0 ～10.9 μg/kg 和 CIP:32.8 ～35.5 μg/kg)［7］等。賈璦等［26］在市政污泥中檢出LOM(0.06±0.98 mg/kg)、PPA(0.04±0.27 mg/kg)、SPA(0.01±0.03 mg/kg)和ENR(0.02±0.07 mg/kg)。PEF和ENO只有在水體介質中被檢出的報道，在污泥中的報道很少［5，27－28］，本實驗中這2 種藥物的檢出濃度分別為9.7 ～34.4 μg/kg 和 51.9 ～174.5 μg/kg。污泥中 OTC的檢出濃度與文獻報道值相當，如日本(OTC:34 μg/kg)［13］。而污泥中AZI的濃度明顯高于德國和瑞士的文獻報道(47～158 μg/kg)［16］。圖1為標準樣品與實際污泥樣品的MRM色譜圖。

表2 污水處理廠活性污泥和剩余污泥樣品中抗生素的檢出濃度Table 2 Concentrations of antibiotics in the actived sludge and excess sluge from sewage treatment plants

(續(xù)表2)

圖1 藥物標準樣品(A)與實際污泥樣品(B)的MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of the drugs standard solution(A)and sludge sample(B)

3 結論

本研究建立了污泥中氯霉素、磺胺類、喹諾酮類、四環(huán)素類和大環(huán)內酯類抗生素殘留的超高效液相色譜－串聯(lián)質譜測定方法。使用超聲萃取對目標藥物進行提取、HLB柱富集、NH2柱凈化。該方法便于操作，靈敏度高，可同時測定多種抗生素，滿足污泥中污染物痕量分析的要求。

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