柱前衍生超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜法測定仙草多糖組成及其含量

張維冰，王智聰，張凌怡，錢俊紅

(華東理工大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，上海 200237)

仙草又名涼粉草、燒仙草，為唇形科仙草屬一年生草本植物，具有“清暑熱，解藏府熱毒”的功效。仙草多糖是仙草中含有的一種具有凝膠性的多糖［1］，研究顯示植物多糖具有廣泛的藥理作用，參與機體各種生理代謝，具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、抑制腫瘤、抗衰老、抗病毒、降血脂、降血糖、抗氧化等多種生物活性［2］。楊敏等［3］用仙草多糖對大鼠肝勻漿進行體外抗氧化試驗，發(fā)現(xiàn)其具有顯著的抗脂質(zhì)過氧化作用。此外，仙草多糖還具有良好的保健性能，但這種多糖在人們?nèi)粘ｏ嬍持泻繕O少［4］。

多糖的單糖組成測定是控制多糖質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和提供多糖基本信息的最重要環(huán)節(jié)。單糖分析有其自身的特點，必須具有高效的分離技術(shù)、高靈敏度的檢測方法，方可實現(xiàn)多糖組成成分的分析及其含量測定。由于糖的特殊結(jié)構(gòu)，其本身不含紫外和熒光吸收的官能團，在反相色譜柱上不保留，也不便于質(zhì)譜直接檢測。因此最常用的是采用衍生方法，不僅可提高檢測靈敏度，也便于糖的分離。根據(jù)衍生原理的不同，除常用的反相液相色譜(RP HPLC)分離外，還可以采用毛細管區(qū)帶電泳(CZE)、毛細管電泳(CE)、聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)、氣相色譜(GC)等進行單糖衍生產(chǎn)物的分離，常用的檢測方法有紫外、熒光、質(zhì)譜等［5－10］。衍生可與糖的還原端反應(yīng)，也可與糖的非還原端反應(yīng)，如利用氨基、羥基或羧基進行衍生。在與糖的還原端反應(yīng)中，常用的方法為還原胺化法，衍生試劑有2-氨基吡啶(2-AP)、8-萘胺-1，3，6-三磺酸(ANTS)、7-萘胺-1，3-二磺酸(ANDS)、2-氨基吖啶酮(2-AMAC)、2-氨基苯甲酰胺(2-ABM)、4-氨基苯甲酸(4-ABA)等。除了還原胺化法外，還有其他與糖的還原端反應(yīng)的衍生化方法，如1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)等，近年來在PMP的基礎(chǔ)上發(fā)展了一些改進的衍生方法，如采用衍生試劑:1-(4-甲氧基苯基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMPMP)［11］，4-(3-甲基-5-氧-2-吡唑啉基)苯甲酸(PMPA)［12］，1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)［13］，1-(4-異丙基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(PPMP)［14］等。馮濤等［4，15－17］采用還原胺化試劑(4-ABA)衍生單糖然后進行液相色譜分析，并將單糖還原成相應(yīng)的乙酸醛醇后用氣相色譜分析了仙草多糖的單糖組成，林少琴等［18］對純化后的仙草多糖采用薄層層析的方法測定了其單糖組成。由于PMP衍生反應(yīng)條件溫和，可以與還原糖進行定量反應(yīng)，且衍生產(chǎn)物無立體異構(gòu)體，并具有較強的紫外吸收，易于質(zhì)子化，而采用質(zhì)譜進行檢測。PMP柱前衍生液相色譜測定單糖的方法經(jīng)過不斷發(fā)展和完善，已廣泛用于植物多糖組成成分的分析，如花楸、沙參、當(dāng)歸、藤三七、蕪菁、淫羊藿多糖等［19－24］。

在上述多糖的單糖組成測定中，因植物提取物成分復(fù)雜，需對植物多糖進行純化精制，單糖的衍生產(chǎn)物和雜質(zhì)必須有足夠的分離度以避免液相分離中雜質(zhì)干擾。另外，多糖水解產(chǎn)物中單糖的含量差異較大，對低含量單糖，采用常規(guī)紫外方法進行檢測的誤差較大，對鼠李糖和核糖也無法實現(xiàn)有效分離。本文采用固相萃取方法純化多糖粗提液，簡化了樣品精制的過程，使用PMP柱前衍生，串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測。該方法具有非常高的靈敏度與選擇性，可對樣品中低含量單糖進行準(zhǔn)確測定。同時，本文測定了仙草多糖水解產(chǎn)生的單糖以及仙草中游離的單糖，對仙草中糖的研究具有非常重要的意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、藥品與試劑

ACQUITY UPLC/TQD超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜系統(tǒng)、Sep－Pak C18固相萃取柱(Waters公司);AG 285型電子天平(Mettler Toledo公司);Millipore超純水儀(美國密理博公司);5810 R冷凍離心機(德國Eppendorf公司);KQ-250B超聲波清洗器(昆州市超聲儀器有限公司);HWS 24型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科技有限公司);202-OA型電熱恒溫干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司)。

甘露糖(Man)、鼠李糖(Rham)、核糖(Rib)、葡萄糖醛酸(GluA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)和巖藻糖(Fuc)對照品(Sigma公司);乙腈、甲醇(色譜純，Merck公司);三氟乙酸、乙酸、乙酸銨(色譜純，Sigma公司);碳酸鈉、氫氧化鈉、濃鹽酸、氯仿(分析純，上海國藥集團);1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(Sigma公司);實驗用水均為超純水;仙草采自福建武平。

1.2 實驗方法

1.2.1 工作溶液的配制 對照品溶液:稱取適量甘露糖、鼠李糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖對照品，加適量水超聲溶解，配制成濃度均為0.1 mol/L的母液，再用水稀釋成濃度為1、2.5、5、10、25、50、75、100 μmol/L的對照品混合工作溶液;內(nèi)標(biāo)溶液:稱取適量巖藻糖對照品，加適量水超聲溶解，使其濃度均為6.1 mmol/L，再用水稀釋成濃度為50 μmol/L的內(nèi)標(biāo)工作溶液;衍生試劑溶液:稱取適量1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮，加甲醇超聲溶解，濃度為0.5 mol/L。

1.2.2 仙草多糖的提取與純化 仙草全草經(jīng)過洗滌、曬干、切斷、粉碎、過篩(20目)后，按照文獻［25］的方法適當(dāng)修改后提取仙草中的多糖，具體步驟為:稱取適量上述過篩后的仙草原料樣品，按照料液比1∶30，加0.3%碳酸鈉溶液浸泡0.5 h，再置于沸水浴中浸提1.5 h，取出冷卻，并以4 000 r/min離心10 min，上清液即為仙草多糖粗提液。固相萃取柱先后各用2 mL甲醇、水活化，取上述仙草多糖粗提液2 mL上樣，收集洗脫液備用。

1.2.3 多糖水解 取“1.2.2”固相萃取后的洗脫液1 mL，加2 mL 4 mol/L三氟乙酸水溶液，漩渦混合，置于110℃烘箱反應(yīng)3 h，取出冷卻至室溫，加2 mL 4 mol/L NaOH溶液中和，漩渦混合后于4 000 r/min離心10 min。

1.2.4 單糖衍生 取“1.2.1”的對照品工作溶液50 μL及“1.2.3”仙草多糖水解上清液50 μL，加50 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液、50 μL 0.3 mol/L NaOH溶液、50 μL 0.5 mol/L PMP溶液，漩渦混合，置于70℃水浴反應(yīng)30 min，取出冷卻至室溫。加50 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和、0.7 mL水稀釋、0.7 mL氯仿萃取，充分振蕩后離心，棄去下層有機相，用氯仿重復(fù)萃取2次，上層水相經(jīng)12 000 r/min離心5 min后，取上清液供液相色譜分析。

1.3 色譜條件

色譜柱:ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm i.d.×50 mm，1.7 μm);流動相A為含0.5 mmol/L乙酸銨及0.05%乙酸的水溶液，流動相B為乙腈;梯度洗脫:0～2 min，15%～17%B，2～3 min，17%～20%B，3～6 min，20%～21%B，6～6.1 min，21%～95%B，6.1～8 min，95%B，8～8.1 min，95%～15%B，8.1～10 min，15%B;流速0.5 mL/min;柱溫35℃;自動進樣器溫度10℃;進樣量2 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

ES正離子模式，毛細管電壓3.0 kV，離子源溫度150℃，脫溶劑氣(氮氣)溫度400℃，霧化氣(氮氣)流速800 L/h，錐孔氣(氮氣)流速50 L/h，碰撞氣(氬氣)流速0.13 mL/min，MRM多反應(yīng)監(jiān)測，駐留時間0.075 s，錐孔電壓50 V，碰撞電壓25 V，質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集時間2.3～6.3 min，色譜流出物在0～2.3 min及6.3～10 min通過閥切換到廢液。

2 結(jié)果與討論

2.1 多糖的提取與純化

植物提取物成分復(fù)雜，已有文獻對多糖的單糖組成進行測定時，大多需要對植物多糖進行純化精制，如經(jīng)過石油醚脫脂、乙醇洗滌、水提取、沉淀蛋白、有機溶劑洗滌等多個過程［23］。上述精制過程不僅步驟繁瑣，小分子糖也被除去。本文采用固相萃取的凈化方法，由于單糖及多糖在C18柱上不保留，樣品經(jīng)固相萃取后，不僅可以除去脂肪、部分黃酮等干擾雜質(zhì)，而且保留了仙草粗提液中的小分子糖，有利于全面了解仙草全草中糖的組成及含量。與多糖精制的樣品前處理方法相比，本文的方法簡單、快速、容易操作。

2.2 多糖水解條件的優(yōu)化

三氟乙酸、硫酸常用來水解多糖。楊興斌等［21］在當(dāng)歸多糖分析中，比較了三氟乙酸、硫酸及其混酸對多糖水解的影響，發(fā)現(xiàn)分別采用三氟乙酸或硫酸的效果差別不大，而混酸效果不好。本實驗比較了4 mol/L三氟乙酸和4 mol/L硫酸對仙草多糖水解的影響，發(fā)現(xiàn)采用硫酸水解后單糖含量非常低，因此后續(xù)實驗中采用三氟乙酸水解多糖。

考察了不同水解時間對水解單糖含量的影響，結(jié)果如圖1所示。隨著水解時間的增加，葡萄糖醛酸的含量逐漸增加，甘露糖、鼠李糖、核糖、葡萄糖、半乳糖、木糖在水解1 h后其含量緩慢下降，而半乳糖醛酸隨著水解時間的增加含量也逐漸增加，在3 h達到最大，之后隨著水解時間的增加其含量逐漸降低。在仙草多糖中，半乳糖醛酸是其特征性的糖酸［26］，綜合考慮，實驗中將多糖水解3 h。

圖1 水解時間對單糖含量的影響Fig.1 Effect of hydrolysis time on monosaccharide content

單糖與衍生試劑需在弱堿性條件下進行反應(yīng)，水解后需要調(diào)整水解液的pH值。實驗比較了氮氣吹干和氫氧化鈉中和的效果。多糖水解中使用三氟乙酸，由于其具有揮發(fā)性，可以采用氮氣吹干的方法，如Duanaliella salina多糖的分析［27］、茶多糖的分析［28］。同時在質(zhì)譜檢測中，為了避免引入無機鹽，氮氣吹干也是較好的方法。但在本實驗中采用氮氣吹干時，仙草多糖水解后的單糖含量非常低，原因尚不清楚，因此實驗改用氫氧化鈉進行中和，此時單糖衍生產(chǎn)物的信號明顯提高，中和產(chǎn)生的無機鹽通過閥切換的方法在進入質(zhì)譜前導(dǎo)入廢液。

2.3 單糖衍生條件的優(yōu)化

Susumu等［29］采用葡萄糖為模型，對衍生條件進行了優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)使用0.3 mol/L NaOH、0.5 mol/L PMP在70℃反應(yīng)30 min時達到最佳的回收率。文獻中使用50 μL 0.5 mol/L PMP溶液，衍生試劑大大過量，本實驗曾嘗試減小衍生試劑的用量，采用單糖混合對照品考察了衍生試劑用量的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，使用50 μL濃度為0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mol/L的PMP溶液時，隨著PMP濃度的減小，單糖衍生產(chǎn)物的信號變小。而對100 μmol/L的8個混合對照品工作溶液，使用50 μL 0.02 mol/L PMP溶液，按照單糖與衍生試劑摩爾比1∶2進行計算，理論上衍生試劑過量11.8倍，但實驗中發(fā)現(xiàn)衍生產(chǎn)物的信號非常小，因此本實驗使用50 μL 0.5 mol/L的衍生試劑。

Dai等［27］在對Duanaliella salina多糖的分析中，考察了衍生反應(yīng)時間的影響，發(fā)現(xiàn)反應(yīng)100 min時衍生產(chǎn)物的信號響應(yīng)達到最大，比反應(yīng)30 min高出30%。Lü等［28］在對茶多糖的分析研究中，采用類似的條件衍生反應(yīng)60 min。對不同的樣品，最佳衍生反應(yīng)時間可能不同，本實驗考察了30、45、60、90、120 min衍生反應(yīng)時間的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，增加反應(yīng)時間對衍生產(chǎn)物信號的影響較小，故本實驗采用30 min為最佳衍生反應(yīng)時間。

2.4 液相色譜及質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在液相色譜紫外檢測中，通常采用磷酸鹽－乙腈體系進行洗脫，但在質(zhì)譜檢測中，不能使用不揮發(fā)性的鹽。實驗首先考察了乙酸水溶液－乙腈體系的效果，但發(fā)現(xiàn)葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸以及葡萄糖和半乳糖的分離度不好，甚至分不開。在水相中添加5 mmol/L乙酸銨后，分離度明顯改善，但質(zhì)譜信號受到明顯抑制，為兼顧分離度和靈敏度，采用0.5 mmol/L乙酸銨+0.05%乙酸水溶液的效果較好，結(jié)果如圖2所示。

圖2 單糖混合對照品及內(nèi)標(biāo)的多反應(yīng)監(jiān)測譜圖Fig.2 MRM chromatograms of monosaccharide mixture standards and internal standard

理論上單糖與衍生試劑PMP按照摩爾比1∶2進行反應(yīng)，但實際上在衍生反應(yīng)中應(yīng)添加過量的衍生試劑，雖然采用氯仿反萃取可以除去大部分過量的衍生試劑，但對于質(zhì)譜，剩余的PMP濃度很高。在UPLC－PDA－MS/MS聯(lián)用的紫外檢測通道中，保留時間1.9 min時出現(xiàn)信號非常強的衍生試劑PMP的色譜峰，因此在進入質(zhì)譜之前需要除去過量的PMP。同時，在多糖水解后，添加氫氧化鈉進行中和，產(chǎn)生了大量的無機鹽;在單糖衍生后，添加鹽酸進行中和，也產(chǎn)生了大量的無機鹽，因此色譜流出物不能直接導(dǎo)入質(zhì)譜。由于無機鹽在反相色譜柱中不保留，將0～2.3 min的色譜流出物通過閥切換到廢液，不僅去除了無機鹽，同時去除了過量的衍生試劑PMP。

2.5 線性關(guān)系與檢出限

表1 8種單糖的線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 1 Linear equations，correlation coefficients(r2)and method detection limits(MDL)of eight monosaccharides

對系列濃度的對照品工作溶液進行衍生后，按照優(yōu)化條件進行分析。以巖藻糖為內(nèi)標(biāo)，內(nèi)標(biāo)法進行定量。以單糖濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進行線性回歸。結(jié)果顯示，各單糖在1～100 μmol/L范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.96。對1 μmol/L的混合對照品溶液進行分析，以S/N=3計算方法檢出限(MDL)，各單糖的檢出限均不高于12.3 nmol/L(見表1)。

2.6 準(zhǔn)確度與精密度

配制濃度為10、25、50 μmol/L的質(zhì)量控制溶液，按照優(yōu)化條件進行分析，各濃度分別配制3個平行樣品，并且分3批進行考察，對每一濃度水平，以9次測定的平均值與理論添加值相比計算回收率表示方法的準(zhǔn)確度;同時，以9次測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示方法的精密度，結(jié)果見表2。各單糖的回收率在84%～112%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均不高于4.7%。方法顯示了良好的準(zhǔn)確度與精密度。

表2 8種單糖的回收率與相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=9)Table 2 Recoveries and RSDs of eight monosaccharides(n=9)

2.7 仙草多糖的組成分析及單糖含量測定

按優(yōu)化條件對仙草多糖進行提取、水解、衍生后，進行測定分析，樣品平行測定3次，結(jié)果用平均值 ±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)來表示(如表3所示)。從表3可知，仙草多糖中含量最高的是半乳糖醛酸和葡萄糖，占總糖組成的50%以上，其次是半乳糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖等。

表3 仙草多糖的單糖組成及含量Table 3 Composition and content of monosaccharides in Mesona Chinensis Benth polysaccharides

根據(jù)相關(guān)文獻報道，林少琴等［18］對仙草多糖進行分離純化后，得到酸性雜多糖，其單糖組成為葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、半乳糖醛酸及一種未知單糖。Feng等［16－17］將仙草多糖純化精制后，用離子交換樹脂進一步分離，得到1種中性多糖和1種酸性多糖，分別對其水解、衍生、色譜分析后，發(fā)現(xiàn)中性多糖中葡萄糖占35%，半乳糖占23%，木糖和阿拉伯糖約占30%，不含半乳糖醛酸;而在酸性多糖中，半乳糖醛酸占49%，木糖和阿拉伯糖約占30%，葡萄糖和半乳糖分別占2%和5.5%。比較兩種單糖組成，發(fā)現(xiàn)酸性多糖中半乳糖醛酸的含量較高，而中性多糖中葡萄糖和半乳糖的含量較高。本實驗測定的單糖中，葡萄糖和半乳糖分別占26.5%和16.4%，半乳糖醛酸占28.4%，表明既包含中性多糖又包含酸性多糖水解產(chǎn)生的單糖，因此，與Feng等［16－17］的實驗結(jié)果相比，葡萄糖和半乳糖的含量比中性多糖少，而比酸性多糖多，對于半乳糖醛酸，其含量比中性多糖多，而比酸性多糖少。同時，本實驗測定的單糖中不僅包含仙草多糖水解產(chǎn)生的單糖，也包含仙草中游離的單糖，能更真實地反映仙草全草中糖的組成及其含量。

圖3為仙草樣品的色譜圖。從圖中可觀察到鼠李糖和核糖的保留時間一致不能分開，但其分子量不同，因此在質(zhì)譜通道可以得到很好的分離。在質(zhì)譜Mass Scan掃描中，對保留時間3.2 min的組分提取離子質(zhì)譜圖，得到481.2和495.2兩個單糖衍生加合物的離子，證實為鼠李糖和核糖。采用紫外檢測器對植物多糖的單糖組成分析中均未包含核糖［19－23］，因為核糖和鼠李糖在液相色譜中不能分開，因此對鼠李糖的定量造成影響。另外，對木糖和阿拉伯糖，本實驗中液相色譜不能將其分開，由于其分子量一致，質(zhì)譜也不能分開，因此在仙草樣品定量分析中，木糖含量實為木糖與阿拉伯糖含量的總和。在質(zhì)譜Mass Scan掃描中，對保留時間5.2 min組分的提取離子質(zhì)譜圖(如圖4所示)，只檢測到481.2的離子，為分子量150的單糖的衍生加合物。由Feng等［16－17］的分析結(jié)果來看，無論是仙草中性多糖還是酸性多糖，阿拉伯糖的含量均比木糖高，進一步說明質(zhì)譜通道中保留時間5.2 min的組分是木糖與阿拉伯糖，而在本文中用木糖含量表示木糖與阿拉伯糖的總量。

圖3 仙草樣品的色譜圖Fig.3 MRM chromatograms of Mesona Chinensis Benth 1－9 were the same as those in Fig.2，10.arabinose

3 結(jié)論

本文建立了1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮柱前衍生超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜測定8種單糖的方法，并成功用于仙草多糖的單糖組成分析。實驗簡化了仙草多糖的凈化步驟，優(yōu)化了多糖水解、單糖衍生及色譜質(zhì)譜分離分析的方法。采用超高效液相色譜－串聯(lián)四極桿質(zhì)譜檢測，分析時間短，靈敏度高，重現(xiàn)性好。結(jié)果表明，仙草多糖由甘露糖、鼠李糖、核糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖8種單糖組成，其摩爾百分比分別為7.4%、5.7%、4.2%、0.9%、28.4%、26.5%、16.4%和10.6%。

圖4 仙草樣品在質(zhì)譜Mass scan掃描中對保留時間5.2 min組分提取的離子質(zhì)譜圖Fig.4 Extracted ions spectrum of Mesona Chinensis Benth under Mass Scan at retention time 5.2 min

［1］Wu L P，Wang Y.Strait Pharm.J.(吳麗萍，王勇.海峽藥學(xué))，2009，21(10):88－90.

［2］Shen L H，Wang J S，Li Y，Zhang D H，Zhu Y C.Chin.Agric.Sci.Bull.(申利紅，王建森，李雅，張大海，朱廷春.中國農(nóng)學(xué)通報)，2011，27(2):349－352.

［3］Yang M，F(xiàn)eng L，Ke X Q.Zhejiang J.Prevent.Med.(楊敏，馮磊，柯雪琴.浙江預(yù)防醫(yī)學(xué))，2002，14(12):42－51.

［4］Feng T，Gu Z B，Jin Z Y.Nat.Prod.Res.Dev.(馮濤，顧正彪，金征宇.天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，2007，19:933－938.

［5］Hase S.J.Chromatogr.A，1996，720:173 －182.

［6］Anumula K R.Anal.Biochem.，2006，350:1－23.

［7］Shen X D，Perreault H.J.Chromatogr.A，1998，811:47－59.

［8］Matute A R，Hernandez O H，Sanchez S R，Sanz M L，Castro I M.J.Chromatogr.B，2011，879:1226－1240.

［9］Fotini N L，Reinhard K，Nikos K K.J.Chromatogr.B，2003，793:15－36.

［10］David J H.J.Chromatogr.B，2011，879:1196－1225.

［11］Kakehi K，Suzuki S，Honda S，Lee Y C.Anal.Biochem.，1991，199:256－268.

［12］Castells C B，Arias V C，Castells R C.Chromatographia，2002，56:153－160.

［13］You J M，Sheng X，Ding C X，Sun Z W，Suo Y R，Wang H L，Li Y L.Anal.Chim.Acta，2008，609:66－75.

［14］Zhang P，Wang Z F，Xie M M，Nie W L，Huang L J.J.Chromatogr.B，2010，878:1135－1144.

［15］Feng T，Gu Z B，Jin Z Y.J.Anhui Agric.Sci.(馮濤，顧正彪，金征宇.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2006，34(10):2059－2060.

［16］Feng T，Gu Z B，Jin Z Y.J.Sci.Food Agric.，2008，88:24－34.

［17］Feng T，Gu Z B，Jin Z Y，Zhuang H N.Carbohydr.Polym.，2008，71:159－169.

［18］Lin S Q，Zhu S M.Nat.Prod.Res.Dev.(林少琴，朱蘇閩.天然產(chǎn)物研究與開發(fā))，1992，4(3):42－47.

［19］Meng L，Chang J M，Sun L，Xue Z Y.Food Sci.(孟磊，常軍民，孫蓮，薛照蕓.食品科學(xué))，2009，30(24):324－326.

［20］Ren H N，Chen X H，Bi K S，Zhang H F.J.Shenyang Pharm.Univ.(任浩娜，陳曉輝，畢開順，張暉芬.沈陽藥科大學(xué)學(xué)報)，2009，26(3):206－209.

［21］Yang X B，Zhao Y，Zhou S Y，Liu L，Wang H F，Mei Q B.Chin.J.Anal.Chem.(楊興斌，趙燕，周四元，劉莉，王海芳，梅其炳.分析化學(xué))，2005，33(9):1287－1290.

［22］Liu Y，Li Q，Wang F，Chen X H，Sun L X，Bi K S.Tradit.Chin.Drug Res.Clin.Pharmacol.(柳楊，李清，王菲，陳曉輝，孫立新，畢開順.中藥新藥與臨床藥理)，2011，22(22):199－202.

［23］Sun L，Ma H M T，Zeng L L，Zhang X.West China J.Pharm.Sci.(孫蓮，馬合木提，曾玲力，張煊.華西藥學(xué)雜志)，2010，25(2):171－172.

［24］Rao J H，Liu W Y，Jiang J Y.Lishizhen Medicine and Materia Medica Research(饒金華，劉文英，江佳峪.時珍國醫(yī)國藥)，2007，18(2):366－367.

［25］Liu F L，F(xiàn)eng C L.Guangdong Agric.Sci.(劉富來，馮翠蘭.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué))，2008，10:80－82.

［26］Feng T，Yu J J，Yang X B.Food Ind.(馮濤，郁晶晶，楊曉波.食品工業(yè))，2010，1:82－85.

［27］Dai J，Wu Y，Chen S Wi，Zhu S，Yin H P，Wang M，Tang J.Carbohydr.Polym.，2010，82:629 －635.

［28］Lü Y，Yang X B，Zhao Y，Ruan Y，Yang Y，Wang Z Z.Food Chem.，2009，112:742－746.

［29］Susumu H，Eiko A，Shigeo S，Masahiro O，Kazuaki K，Jun N.Anal.Biochem.，1989，180:351－357.