大豆皂甙對糖尿病大鼠血清及心肌組織IL-6和TNF-α表達(dá)的影響①

李冬梅 汪 偉 黃可欣 馬洪喜

(長春大學(xué)特殊教育學(xué)院，長春130022)

近年來，糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)已成為糖尿病并發(fā)癥研究的重點與熱點問題之一［1］。國內(nèi)外大量的研究資料表明，大豆皂甙具有抗疲勞、抗衰老、抗炎癥及抗腫瘤的作用，但其在此過程中的具體作用機(jī)制尚不明確［2，3］。前期研究發(fā)現(xiàn)，大豆皂甙在糖尿病的病變中有降血糖、促胰島素分泌等作用，說明它對糖尿病的進(jìn)程有一定的調(diào)控作用，從而起到治療作用［4］。本實驗通過建立糖尿病模型，監(jiān)測糖尿病大鼠白細(xì)胞介素6(Interleukin-6)和腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor-alpha)的水平變化，觀察大豆皂甙對其的影響，研究大豆皂甙對糖尿病心肌組織的保護(hù)作用，為大豆皂甙應(yīng)用于臨床防治糖尿病并發(fā)癥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑及分組 健康雄性Wistar大鼠45只，體質(zhì)量為(200±20)克由吉林省藥品檢驗所提供(動物合格證號960101032);隨機(jī)取10只動物做正常對照組，造模35只，將造模成功的30只動物隨機(jī)分為糖尿病對照組(15只)、大豆皂甙給藥組(15只)。大豆皂甙(SS)由吉林省中醫(yī)中藥研究所提供;實驗用大豆皂甙用生理鹽水稀釋;鏈脲佐菌素(STZ)購于Sigma公司;IL-6和 TNF-α的ELISA檢測試劑盒購于南京建成生物有限公司;IL-6和TNF-α一抗購自Santa Crus公司，二抗、三抗和DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物有限公司。

1.2 動物模型制備及給藥 隨機(jī)選取實驗動物35只，腹腔注射STZ:STZ本身對心肌沒有影響，其特性是對一定種屬動物的胰島β細(xì)胞有選擇性破壞作用(用新配制的枸櫞酸緩沖液溶解)50 mg/kg;48小時后采尾血測空腹血糖，濃度大于16.7 mmol/L為模型復(fù)制成功［5］。造模成功后正常對照組、糖尿病模型組和大豆皂甙給藥組分別給予檸檬酸緩沖液、生理鹽水和大豆皂甙(10 mg/kg)，每日灌胃，連續(xù)3個月。

1.3 標(biāo)本采集 實驗結(jié)束后，清晨乙醚麻醉摘取眼球取血，留血清待測;然后迅速處死取出心臟，一部分凍存用于心肌組織IL-6和TNF-α的測定，取心尖組織固定于10%中性福爾馬林液中，每組取10個心臟，常規(guī)石蠟包埋，切成4微米切片2張，分別進(jìn)行IL-6和TNF-α的免疫組化染色。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 血清及心肌組織IL-6、TNF-α 蛋白水平的檢測 采用ELISA酶聯(lián)免疫法檢測，操作嚴(yán)格按照試劑盒使用說明。

1.4.2 心肌組織IL-6和TNF-α百分率的檢測 采用流式細(xì)胞免疫學(xué)方法(美國BD公司產(chǎn)流式細(xì)胞儀)，IL-6和TNF-α的表達(dá)以陽性細(xì)胞百分率(%)表示。

1.4.3 心肌組織的病理學(xué)檢測 采用HE染色法檢測;光鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)染為粉紅色，細(xì)胞核染為藍(lán)色。

1.4.4 心肌組織IL-6和TNF-α免疫組織化學(xué)的檢測 采用SP免疫組織化學(xué)染色法檢測;光鏡下觀察見棕黃色為陽性表達(dá)，結(jié)果分析采用Motic Images Advanced 3.2圖像分析系統(tǒng)測灰度值，灰度值越低，蛋白含量越高。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，血清及心肌組織IL-6和TNF-α的蛋白水平、心肌組織IL-6、TNF-α的百分率及免疫組織化學(xué)灰度值檢測數(shù)據(jù)均以±s表示，采用t檢驗，檢驗標(biāo)準(zhǔn) α =0.05。

2 結(jié)果

對照組大鼠體重明顯增加，精神狀態(tài)好，毛皮有光澤，反應(yīng)靈敏。糖尿病組大鼠明顯消瘦，精神萎靡，毛皮無光澤，反應(yīng)遲鈍。大豆皂甙治療組大鼠體重、精神狀態(tài)、毛皮光澤和反應(yīng)度較對照組差，但明顯好于糖尿病組。

2.1 各組血清及心肌組織IL-6、TNF-α蛋白水平的比較 模型組大鼠血清及心肌組織IL-6、TNF-α蛋白水平明顯高于對照組和SS給藥組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，SS給藥組略高于對照組但無顯著差異(P ＞0.01);見表1。

2.2 各組心肌組織IL-6和TNF-α百分率的比較模型組大鼠心肌組織IL-6和TNF-α百分率明顯高于對照組和SS給藥組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，SS給藥組略高于對照組但無顯著差異(P＞0.01);見表2。

2.3 各組心肌組織的病理學(xué)比較 光鏡下可見對照組大鼠心肌細(xì)胞排列緊密整齊、染色均勻;糖尿病組大鼠心肌細(xì)胞排列疏散紊亂染色不均、間質(zhì)可見炎細(xì)胞浸潤;大豆皂甙治療組大鼠心肌細(xì)胞基本排列整齊緊密、染色不均少見;見圖1。

2.4 各組心肌組織IL-6和TNF-α免疫組織化學(xué)染色強(qiáng)度及灰度值的比較 免疫組化染色顯示，棕黃色為陽性表達(dá)，其表達(dá)見于細(xì)胞質(zhì)中;模型組大鼠心肌組織IL-6和TNF-α染色陽性強(qiáng)度明顯高于對照組和SS給藥組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，灰度值明顯低于對照組和SS給藥組有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);SS給藥組染色強(qiáng)度略高于對照組但無顯著差異(P＞0.01)，灰度值略低于對照組但無顯著差異(P＞0.01);圖像分析結(jié)果見表3，染色結(jié)果見圖2、3。

表1 各組血清及心肌組織IL-6和TNF-α蛋白水平的比較(n=10，±s)Tab.1 The comparision of IL-6 and TNF-α protein levels on serum and myocardial tissue(n=10，±s)

表1 各組血清及心肌組織IL-6和TNF-α蛋白水平的比較(n=10，±s)Tab.1 The comparision of IL-6 and TNF-α protein levels on serum and myocardial tissue(n=10，±s)

Note:1)P ＜0.01，compared with control group;2)P ＞0.01，compared with control group.

Groups Serum Myocardial tissue IL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)IL-6(ng/L)TNF-α(ng/L)Control group 0.83 ±0.16 2.13 ±0.46 0.91 ±0.232.19 ±0.34 DM group 3.24 ±0.491)5.37 ±0.651)3.63 ±0.581)6.02 ±0.711)SS group 0.91 ±0.332)2.34 ±0.512)1.03 ±0.522)2.41 ±0.732)

表2 各組心肌組織IL-6和TNF-α百分率的比較(n=10，±s)Tab.2 The comparision of IL-6 and TNF-α percentage on myocardial tissue(n=10，±s)

表2 各組心肌組織IL-6和TNF-α百分率的比較(n=10，±s)Tab.2 The comparision of IL-6 and TNF-α percentage on myocardial tissue(n=10，±s)

Note:1)P ＜0.01，compared with control group;2)P ＞0.01，compared with control group.

Groups IL-6(%) TNF-α(%)Control group 41.25 ±3.62 51.22 ±3.18 DM group 78.13 ±4.211) 82.65 ±8.221)SS group 45.11 ±5.282) 53.69 ±4.172)

表3 各組心肌組織IL-6和TNF-α灰度值的比較(n=10，±s)Tab.3 The comparision of IL-6 and TNF-α on grey value(n=10，±s)

表3 各組心肌組織IL-6和TNF-α灰度值的比較(n=10，±s)Tab.3 The comparision of IL-6 and TNF-α on grey value(n=10，±s)

Note:1)P ＜0.01，compared with control group;2)P ＞0.01，compared with control group.

Groups IL-6 TNF-α Control group 136.25 ±4.52 128.37 ±4.13 DM group 82.62 ±3.851) 80.14 ±3.851)SS group 125.34 ±4.162) 120.11 ±4.382)

圖1 心肌組織中IL-6的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)Fig.1 IL-6 expression in myocardiac tissue(immunohistochemical staining ，×400)

圖2 心肌組織中TNF-α的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)Fig.2 TNF-α expression in myocardiac tissue(immunohistochemical staining ，×400)

圖3 心肌細(xì)胞的組織病理改變(HE染色，×400)Fig.3 Histopathological changes in myocardiac tissue(HE染色 ，×400)

3 討論

糖尿病心肌病是指發(fā)生于糖尿病患者，不能用高血壓性心臟病、冠狀動脈硬化性心臟病、心臟瓣膜病及其它心臟病變來解釋的心肌疾病，它是糖尿病的主要心臟并發(fā)癥之一，發(fā)病率高、危害性大，與糖尿病繼發(fā)心血管疾病的高發(fā)生率和高病死率密切相關(guān)［6］;它是一種特異性心肌病，病理表現(xiàn)為心肌肥厚和心肌纖維化，臨床早期通常表現(xiàn)為心肌順應(yīng)性降低和舒張期充盈受阻為主的舒張功能不全，晚期以收縮功能不全為主，易發(fā)生充血性心力衰竭、心源性休克、重癥患者甚至猝死［7，8］。

白細(xì)胞介素(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)都是細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)過程和能量代謝調(diào)節(jié)［9］。IL-6它可直接作用于胰島β細(xì)胞造成其損傷，誘發(fā)胰島素抵抗，降低胰島素的分泌［10］。TNF-α主要由巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，心臟既是TNF-α產(chǎn)生的主要場所，同時又是TNF-α作用的靶器官［11］，過量的 IL-6和 TNF-α作為炎癥介質(zhì)可介導(dǎo)免疫損傷及一些嚴(yán)重的病理生理過程。本實驗室以往的研究證明，大豆皂甙在糖尿病的病變中有降血糖、促胰島素分泌等作用，它可能是通過保護(hù)胰島B細(xì)胞或促進(jìn)受損B細(xì)胞的修復(fù)而提高血清胰島素水平，通過促進(jìn)糖原合成而增加肝糖原含量［3］。

本室前期研究證實大豆皂甙在糖尿病的病變中有降血糖、促胰島素分泌等作用，從而對糖尿病起到治療作用，能夠延緩糖尿病心肌病的發(fā)生對心肌組織起保護(hù)作用［4］。本實驗研究表明，糖尿病模型組大鼠血清及心肌組織IL-6和TNF-α蛋白水平明顯高于正常組和大豆皂甙給藥組(P＜0.01)、心肌組織IL-6和TNF-α的百分率明顯高于正常組和大豆皂甙給藥組(P＜0.01)、心肌組織IL-6和TNF-α的免疫組化陽性強(qiáng)度明顯高于正常組和大豆皂甙給藥組(P＜0.01);提示IL-6和TNF-α參與了糖尿病心肌病的發(fā)生和發(fā)展。同時本實驗的心肌病理組織切片顯示，模型組心肌細(xì)胞排列紊亂、腫脹而且肥大，細(xì)胞間隙增大，心肌間質(zhì)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤、大豆皂甙治療組明顯得到改善，心肌細(xì)胞基本排列整齊，可見少量炎細(xì)胞浸潤，進(jìn)一步表明對糖尿病心肌病的保護(hù)作用。綜上所述，炎癥因子參與了糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展過程，大豆皂甙對糖尿病繼發(fā)的心肌病變具有良好保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低炎癥因子的表達(dá)有關(guān)，為大豆皂甙進(jìn)一步應(yīng)用于臨床糖尿病并發(fā)癥的防治提供實驗依據(jù)。

1 伏鵬榮，叢曉東，張 云et al.糖尿病心肌病發(fā)病機(jī)制，靶點和中藥治療［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012;12(6):1179-1182.

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3 王銀萍，吳家祥，張鳳蘭et al.大豆皂甙和人參莖葉皂甙對糖尿病大鼠血SOD和LPO的影響［J］.白求恩醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，1993;19(2):122-123.

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