CD123+CD11c－pDC在初發(fā)類風濕關節(jié)炎患者外周血及關節(jié)液中的表達①

羅 莉 胡永瑋 劉盼盼 吉 鵬 杜文靜

(新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕科，烏魯木齊830054)

類風濕關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性對稱性炎癥性多關節(jié)炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，其發(fā)生、發(fā)展與多種誘發(fā)因素及機體免疫紊亂相關，其中抗原提呈功能異常是重要的一部分。樹突狀細胞(Dendritic cell，DC)是目前所知功能最強大的抗原提呈細胞，通過起始機體免疫應答，誘發(fā)免疫耐受等參與免疫反應。CD123+CD11c－是淋巴系來源的樹突狀細胞的標記分子［1］，CD123+CD11c－樹突狀細胞在RA中的免疫作用已受到關注，但目前研究較少。我們擬通過測定RA患者外周血及關節(jié)液中pDC的表達水平，探討其在RA發(fā)病機制中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象及主要試劑

1.1.1 研究對象 RA組:30例類風濕關節(jié)炎患者，均來自新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕科住院患者，符合1987年美國風濕病學會(ACR)修訂的RA診斷標準。所有患者均符合RA活動指標:晨僵時間＞1小時，腫脹關節(jié)數(shù)＞4個，壓痛關節(jié)數(shù)＞5個，紅細胞沉降率(ESR)＞28 mm/h，C反應蛋白(CRP)＞8 mg/L。研究納入患者均為初次發(fā)病，就診前未用過緩解病情抗風濕藥或激素類藥物。其中男性4例，女性26例，年齡25～63歲，平均(47±4.9)歲，OA組:選取新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院風濕科住院患者，符合美國風濕病協(xié)會制定的骨關節(jié)炎診斷標準，其中男性5人，女性20人。排除其他風濕性疾病。健康對照組:本院職工健康志愿者25人，男性5人，女性20人，體檢各項指標均在正常范圍內，與RA組在年齡和性別上均匹配。

1.1.2 主要試劑 2011年試驗所用試劑:FITC標記的抗人MHCⅡ;PE標記的抗人CD123;PE-cy7標記的抗人CD11c以及同型對照抗體均購自BD/Pharmingen公司(Becton Dickinson/PharMingen USA)。紅細胞裂解液購自Beckman Coulter公司。2012年試驗所用試劑:FITC標記的抗人Lineage 2;PE標記的抗人CD123;PerCP-Cy5.5標記的MHCⅡ;PE-cy7標記的抗人CD11c以及同型對照抗體均購自BD/Pharmingen公司(Becton Dickinson/PharMingen USA)。紅細胞裂解液購自Beckman Coulter公司。

1.1.3 主要儀器 流式細胞儀(BD LSRⅡ，USA);離心機 Centrifuge 5810R(Effendorf，Germany)。

1.2 免疫熒光標記和流式細胞術檢測 收集患者及對照組外周抗凝血及關節(jié)積液100 μl，分別加入FITC標記的抗人 MHCⅡ抗體，PE標記的抗人CD123抗體，PE-cy7標記的抗人CD11c抗體各20 μl;或 FITC標記的抗人 Lineage 2抗體;PE標記的抗人CD123抗體;PerCP-Cy5.5標記的MHCⅡ抗體;PE-cy7標記的抗人CD11c抗體各20 μl;同型對照管100 μl抗凝血中分別加入同型對照20 μl。室溫避光孵育30分鐘，加入紅細胞裂解液500 μl，PBS洗滌2次，離心后棄上清，然后再加入100 μl FACS緩沖液重懸細胞置于流式細胞儀上檢測。使用美國BD公司的LSRⅡ流式細胞儀，按規(guī)程操作。

1.3 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理。數(shù)據(jù)以±s表示，根據(jù)方差齊性檢驗結果，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，不同指標之間進行Spearman相關分析。

2 結果

2.1 RA組與OA組及健康對照組外周血CD123+CD11c－pDC細胞百分率比較 RA組外周血CD123+CD11c－pDC 細胞百分率(1.69% ±0.97%)低于 OA組(5.38% ±2.31%)及健康對照組(5.63% ±2.33%)，差異分別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見表1，圖1。

表1 RA組與OA組及健康對照組外周血中pDC百分率比較(±s，%)Tab.1 pDC percentage in peripheral blood of RA group，OA group and control group(±s，%)

表1 RA組與OA組及健康對照組外周血中pDC百分率比較(±s，%)Tab.1 pDC percentage in peripheral blood of RA group，OA group and control group(±s，%)

Note:Compared to OA group，1)P ＜0.05;compared to control group，2)P ＞0.05;compared to RA group，3)P ＜0.05.

Groups n Perpheral blood RA 30 1.69% ±0.97%1)OA 25 5.38% ±2.31%2)Control 25 5.63% ±2.33%3)

圖1 流式細胞術檢測RA組與對照組外周血中pDC細胞百分率的表達Fig.1 Expressing of individual pDC percentage in the peripheral blood control and RA patients

表2 RA組與OA組關節(jié)液中pDC百分率比較(±s，%)Tab.2 pDC percentage in synovial fluid of RA group and OA group(±s，%)

表2 RA組與OA組關節(jié)液中pDC百分率比較(±s，%)Tab.2 pDC percentage in synovial fluid of RA group and OA group(±s，%)

Note:Compared to OA group，1)P ＞0.05.

Groups n Synovial fluid RA 30 3.63% ±2.7%1)OA 25 1.84% ±1.67%

2.2 OA組和健康對照組外周血CD123+CD11cpDC細胞百分率比較 OA組外周血CD123+CD11c－pDC 細胞百分率(5.38% ±2.31%)低于健康對照組(5.63% ±2.33%)，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，見表1。

2.3 RA組與OA組關節(jié)液CD123+CD11c－pDC細胞百分率比較 RA組關節(jié)液CD123+CD11c－pDC細胞百分率(3.63% ±2.7%)高于對照組(1.84% ±1.67%)，差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)，見表2。

2.3 RA患者外周血pDC百分率與臨床指標的相關性分析 利用統(tǒng)計軟件對RA患者外周血及關節(jié)液pDC細胞百分率與臨床指標進行相關性分析，兩者與疾病DAS28評分無相關性，與疾病活動度指標ESR、CRP和RF亦無相關性。

3 討論

類風濕性關節(jié)炎(RA)是一種常見的自身免疫性疾病，在全世界約有1%的人患有此病。其特點是以關節(jié)滑膜炎為特征的慢性全身性炎性反應，滑膜炎持久反復發(fā)作，導致關節(jié)內軟骨和骨質破壞，關節(jié)功能障礙，終致殘廢。其發(fā)病機制尚不十分明確，發(fā)病機理復雜，目前認為主要以細胞免疫為主，單核細胞、巨噬細胞、樹突狀細胞、B細胞、活化T細胞通過多種途徑影響滑膜細胞和淋巴細胞的增殖和分化，促進滑膜細胞和軟骨細胞合成并釋放炎癥介質，引發(fā)滑膜的炎性反應、軟骨基質的崩解，造成關節(jié)損傷［2］。樹突狀細胞是其中功能強大的抗原提呈細胞，近年研究發(fā)現(xiàn)DC在RA中誘導初始T細胞分化為Th1細胞或Th2細胞，調節(jié)Th1/Th2的平衡、在不同成熟狀態(tài)誘導T細胞產(chǎn)生促炎或抑炎因子參與細胞免疫。還可誘導T細胞依賴或非依賴性B細胞向漿細胞分化，調節(jié)自身抗體生成，參與部分體液免疫［3］。

人DC的來源可分為兩個亞群:骨髓系來源的樹突狀細胞(Myeloid dendritic cell，mDc)，高表達CD11c，低表達CD123;淋巴系來源的漿細胞樣樹突狀細胞(pDC)，高表達 CD123，不表達CD11c等髓系標記［1］。國外研究者在人類扁桃體中發(fā)現(xiàn)表達CD4+CD3－CD11c－的細胞出現(xiàn)在 T細胞聚集區(qū)［4，5］，但不表達 T細胞受體。進一步發(fā)現(xiàn)細胞形態(tài)似淋巴樣，類漿細胞樣，在 IL-3或 IL-3聯(lián)合CD40L刺激下可分化為成熟的樹突狀細胞。而CD123為DC細胞表面IL-3受體α鏈，在人pDC高表達。因此推測表達CD123但不表達CD11c的DC為不成熟pDC。故本實驗中CD123+CD11c-標記的DC為不成熟狀態(tài)的pDC。

Sarah L Jongbloed等［6］報道稱RA患者外周血及關節(jié)液中pDC均處在不成熟狀態(tài)，關節(jié)液較外周血細胞更為幼稚。未成熟pDC可誘導T細胞失能，有研究發(fā)現(xiàn)自身免疫性硬化病中存在對拓撲異構酶I特異性反應的CD4+T細胞，當這些CD4+細胞與用該酶沖擊過的人外周血未成熟pDC培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)CD4+T細胞失能，不能對特異抗原刺激表現(xiàn)出增殖反應，對B細胞自身抗體協(xié)同刺激作用消失。結果提示外周不成熟pDC可誘導自身CD4+T細胞介導免疫反應無應答［7］。經(jīng)IL-3及CD40L刺激后，pDC可誘導幼稚型T細胞分化為CD8+調節(jié)性T細胞，促進Th2生成并分泌IL-4、IL-5、IL-10，抑制炎癥反應［8］。本實驗中RA組外周血pDC較對照組有顯著下降，這與Christophe Richez等人［3］的研究結果一致。推測在外周血中CD123+CD11c－pDC數(shù)量減少，其誘導失能及抑制性免疫作用減弱，相對促進全身免疫反應。故實驗結果提示RA患者體內存在細胞免疫功能的紊亂。

Roberto Lande等［9］發(fā)現(xiàn)RA患者關節(jié)液存在抑制pDC成熟的細胞因子，且在Lin-CD123++pDC表面發(fā)現(xiàn)表達下調細胞成熟的BDCA2，提示關節(jié)液中pDC也處于不成熟狀態(tài)。唐蓓［10］發(fā)現(xiàn)在DC成熟過程中，MHCⅡ表達增高，并表達協(xié)同刺激分子CD80、CD86、CD40。Jongbloed 等［6］分離 RA 患者關節(jié)液中pDC，并經(jīng)CpG ODN2216刺激后發(fā)現(xiàn)其高表達CD80、CD83及CCR7，刺激成熟后的pDC釋放大量IFN-ɑ和TNF-ɑ，IL-10參與免疫反應。而僅IL-3刺激pDC不能表達成熟標記。本實驗中測定關節(jié)液中CD123+CD11c－pDC含量較對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。推測關節(jié)液中CD123+CD11c－pDC未經(jīng)刺激成熟，其產(chǎn)生釋放細胞因子能力弱，在關節(jié)炎癥反應中不是主要調節(jié)細胞，在RA疾病進展中不是扮演主要角色。而本實驗中還發(fā)現(xiàn)RA組外周血及關節(jié)液中pDC含量與DSA28評分，疾病活動指標均無相關性，進一步闡釋CD123+CD11c－pDC與RA疾病發(fā)展缺乏相關性。

本研究中入組患者均為初發(fā)RA患者，未經(jīng)藥物治療，體內免疫狀態(tài)為初始狀態(tài)，無藥物干擾，故實驗測定指標較為準確。研究結果提示CD123+CD11c－pDC在RA外周血中含量降低，免疫耐受能力減弱，相對促進全身炎癥反應。為進一步明確pDC在類風濕關節(jié)炎患者靶器官的相關聯(lián)系，我們計劃測定不同成熟狀態(tài)pDC及相關細胞因子、轉錄因子、信號傳導途徑等變化，深入分析pDC在類風濕關節(jié)炎中的作用機制。

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3 Christophe Richez，Schaeverbeke T，Dumoulin C et al.Myeloid dendritic cells correlate with clinical response whereas plasmacytoid dendritic cells impact autoantibody development in rheumatoid arthritis patients treated with infliximab［J］.Arthritis Research ＆ Therapy，2009;11:100-113.

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8 Rissoan M C，Soumelis V，Kadowaki N et al.Reciprocal control of T helper cell and dendritic cell differentiation.［J］Science，1999;283:1183-1186.

9 Roberto Lande，Elena Giacomini，Barbara Serafini et al.Characterization and recruitment of plasmacytoid dendritic cells in synovial fluid and tissue of patients with chronic inflammatory arthritis［J］Immunol，2004;173:2815-2824.

10 唐 蓓.LPS介導的樹突狀細胞成熟過程中的表型變化［J］.中國免疫學雜志，2012;28(2):114-121.