建立結(jié)核分枝桿菌抗原K6 IFN-γ ELISPOT用于結(jié)核病輔助診斷①

蔣麗氣 黃香玉 陳紅兵 李 靜 何 珂 邵進(jìn)士 張春青 何秀云

(西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶400715)

雖然近幾年結(jié)核病得到一定控制，但全球結(jié)核病疫情仍然十分嚴(yán)重。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，全世界約有880萬新增結(jié)核病患者［1］。WHO提出全球結(jié)核病控制目標(biāo)為2050年發(fā)病率低于百萬分之一，為了實(shí)現(xiàn)該目標(biāo)，結(jié)核病疫苗、結(jié)核病診斷和治療均需獲得重大突破［2］。目前結(jié)核病診斷主要依據(jù)臨床表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、實(shí)驗(yàn)室檢測(血清結(jié)核抗體檢測、分子生物學(xué)檢測(PCR、核酸雜交)、細(xì)菌學(xué)檢查(涂片抗酸染色、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)、噬菌體、化學(xué)發(fā)光)等［3］，這些方法有的敏感度低、有的檢測周期長、有的需技術(shù)含量高［3，4］。我國規(guī)定結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性為診斷金標(biāo)準(zhǔn)［3］。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)需時太長、不能滿足臨床。血清抗體檢測、結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)(TST)、涂片抗酸染色等均可做到快速檢測，但WHO于2011年7月提出結(jié)核病血清抗體作為結(jié)核病診斷可能存在誤診(www.who.org)、TST特異度低、涂片抗酸染色敏感度低。

結(jié)核分枝桿菌致敏的T淋巴細(xì)胞，再次受到相關(guān)抗原刺激后能迅速活化增殖并釋放γ-干擾素(IFN-γ)。IFN-γ 釋放試驗(yàn)(Interferon gamma release assay，IGRA)是目前特異度高、快速、且可取代TST試驗(yàn)最有效方法，IGRA包括酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法(ELISPOT)或酶聯(lián)免疫吸附劑測定法(ELISA)。澳大利亞生產(chǎn)的QFT試劑盒(ELISA)和英國生產(chǎn)的TSPOT.TB試劑盒(ELISPOT)已批準(zhǔn)用于臨床檢測結(jié)核分枝桿菌感染。QFT試劑盒刺激抗原有3個，即6 kD早期分泌抗原靶(ESAT-6)、培養(yǎng)濾過蛋白10(CFP-10)和RD11區(qū)TB7.7，3個抗原加入同一管共同刺激［4］。T-SPOT.TB試劑盒刺激抗原為抗原A(ESAT-6多肽)和抗原B(CFP-10多肽)，抗原A 和抗原 B 單獨(dú)刺激［2，4，5］。國外生產(chǎn)試劑盒在中國銷售價格昂貴，為了降低檢測費(fèi)用，國內(nèi)多家科研單位或(和)生物公司進(jìn)行結(jié)核IGRA試劑盒研發(fā)。從去年開始，我國研制的結(jié)核IGRA檢測試劑盒陸續(xù)獲得國家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的注冊證書。因此，IGRA用于結(jié)核病細(xì)胞免疫學(xué)診斷逐漸得到重視和認(rèn)可。但是，國內(nèi)外獲批準(zhǔn)的結(jié)核IGRA試劑盒所用刺激抗原均包含ESAT-6和 CFP-10抗原或其多肽、且不能區(qū)分活動性結(jié)核病和結(jié)核分枝桿菌潛伏感染。因此篩選新刺激抗原，研制具有自主知識產(chǎn)權(quán)的結(jié)核IGRA試劑盒用于活動性結(jié)核病診斷具有重要意義。

基因工程技術(shù)獲得了一種結(jié)核分枝桿菌融合蛋白(K6)，前期研究發(fā)現(xiàn)K6與佐劑聯(lián)合免疫小鼠可產(chǎn)生較高水平IFN-γ，本文建立K6作為刺激原的IFN-γ ELISPOT檢測方法，并初步評價該方法用于結(jié)核病輔助診斷價值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器設(shè)備 BSC-1360 A2二級生物安全柜(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司)，CO2培養(yǎng)箱(日本三洋)，臺式低速離心機(jī)(L-530，湖南湘儀離心機(jī)有限公司)，熒光顯微鏡(Olympus cx31，日本)，酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)讀板儀［Cellular Technology Limited(CTL)，美國］。

1.1.2 試劑 結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)檢測試劑盒［TSPOT.TB(Oxford Immunotec，UK)］購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司，RPMI1640培養(yǎng)液(Thermo)購自北京索萊寶科技有限公司，結(jié)核分枝桿菌重組融合抗原K6(本室研制)，人全血淋巴細(xì)胞分離液購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司，AIM培養(yǎng)基購自上海復(fù)星長征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 對象 解放軍第三O九醫(yī)院結(jié)核病研究所2012年3～6月新入院且臨床最終確診的結(jié)核病患者85例，其中單一肺結(jié)核病患者29例、肺結(jié)核病合并其它部位結(jié)核病患者43例、肺外結(jié)核病患13例。男59例、女26例，平均年齡36.6歲(11～79歲)。56例非結(jié)核性肺部相關(guān)疾病(肺炎和肺癌)患者來自解放軍第三O九醫(yī)院呼吸科和腫瘤科，男35例、女21例，平均年齡58.3歲(20～89歲)。肺結(jié)核病診斷標(biāo)準(zhǔn):(1)典型肺結(jié)核臨床癥狀和胸部X射線表現(xiàn);(2)痰或支氣管灌洗液涂片抗酸染色陽性;(3)痰或支氣管灌洗液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性;(4)痰結(jié)核分枝桿菌PCR陽性;(5)PPD(5 TU)強(qiáng)陽性，血清抗結(jié)核抗體陽性;(6)臨床可排除其它非結(jié)核性肺部疾患;(7)抗結(jié)核治療有效。符合(1)和(7)及(2)～(6)中至少2項(xiàng)者診斷為肺結(jié)核。肺外結(jié)核和肺炎為臨床綜合診斷，肺癌經(jīng)病理確診。

1.2.2 外周血單個核細(xì)胞分離 新入院結(jié)核病患者(抗結(jié)核藥物治療前)和非結(jié)核性肺部相關(guān)疾病患者靜脈抽取4 ml外周血于肝素鋰抗凝管中，外周血與等體積無菌生理鹽水上下顛倒混勻，無菌吸管吸取上述稀釋外周血緩慢加入到與外周血等體積的人單個核細(xì)胞分離液上面，1 700 r/min常溫離心20分鐘;用無菌吸管吸起環(huán)狀乳白色PBMC層，10 ml RPMI1640培養(yǎng)基洗滌兩次，2 000 r/min離心10分鐘;0.5 ml AIM懸浮細(xì)胞沉淀，取10 μl細(xì)胞稀釋50倍，臺盼藍(lán)染色，計(jì)數(shù)，細(xì)胞活率均在90%以上，調(diào)整細(xì)胞濃度2.5×106個/ml。

1.2.3 ELISPOT檢測分泌IFN-γ的斑點(diǎn)形成細(xì)胞數(shù)(Spot forming cells，SFC) 按T-SPOT.TB試劑盒說明書稍加改進(jìn)。具體為:依次加入50 μl AIM(陰性對照)、陽性質(zhì)控、抗原A、B和1～4個不同濃度抗原K6(根據(jù)細(xì)胞數(shù))于對應(yīng)的檢測孔，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，于 5%CO2、37℃ 孵育過夜(20 ～24小時)。取出微孔板棄去細(xì)胞懸液，每孔加200 μl PBS(0.22 μm過濾)洗板至少6次，每孔依次加入50 μl堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，4℃孵育60分鐘;棄去酶溶液，同上洗板至少6次，每孔加入50 μl BCIP/NBT底物溶液，室溫放置7分鐘，蒸餾水洗滌各孔，將微孔板置通風(fēng)處避光干燥。酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)讀板儀自動檢測SFC數(shù)。當(dāng)陽性質(zhì)控孔中SFC遍布整個反應(yīng)孔為有效，陰性對照孔SFC數(shù)為0～5個時且(抗原A、B或K6孔的SFC數(shù))-(陰性對照孔SFC數(shù))≥6或陰性對照孔SFC數(shù)≥6時且(抗原A、B或K6孔的SFC數(shù))≥2×(陰性對照孔SFC數(shù))為相應(yīng)抗原刺激反應(yīng)陽性;反之判為陰性。若陽性質(zhì)控孔SFC數(shù)量小于20，則判定試驗(yàn)無效。

1.3 結(jié)果分析 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，敏感度和特異度采用卡方(χ2)檢驗(yàn)，SFC數(shù)量平均值比較采用一元方差分析，抗原K6、抗原A和抗原B診斷一致性采用非參數(shù)Kappa檢驗(yàn)，抗原K6、抗原A和抗原B刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數(shù)量相關(guān)分析采用Bivariate Correlations;P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GraphPad Prim 5軟件繪制散點(diǎn)圖。

2 結(jié)果

2.1 抗原K6 IFN-γ ELISPOT用于結(jié)核病輔助診斷

2.1.1 統(tǒng)計(jì)病例 新入院高度懷疑結(jié)核病的患者納入，出院時臨床明確診斷不是結(jié)核病病例剔除。肺癌為病理確診、肺炎為臨床診斷，兩類患者均未進(jìn)行結(jié)核分枝桿菌感染篩查。因?yàn)椴捎眠M(jìn)口結(jié)核病臨床診斷試劑盒、一份標(biāo)本同時進(jìn)行自研制抗原K6與試劑盒抗原A和抗原B比較;另一方面，針對新入結(jié)核病患者是排除不同化療或免疫治療對IFN-γ ELISPOT檢測的影響。結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性較低，獲得具有統(tǒng)計(jì)意義的培陽肺結(jié)核需要基數(shù)大，試劑盒價格昂貴。基于以上考慮，結(jié)核病患者未按金標(biāo)準(zhǔn)選擇病例、而是綜合診斷。統(tǒng)計(jì)時只分為結(jié)核病組(包括肺結(jié)核患者29例、肺結(jié)核合并其它肺外結(jié)核43例和肺外結(jié)核13例)和非結(jié)核性肺部相關(guān)疾病組(肺癌17例、肺炎39例)。

2.1.2 抗原K6刺激PBMC分泌IFN-γ 預(yù)試驗(yàn)比較了2.5、5、10和20 μg/ml K6對 SFC數(shù)量和敏感度影響，2.5 μg/ml抗原獲得SFC數(shù)量與其它3個濃度抗原刺激SFC比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖1);但敏感度顯著低于5 μg/ml(71.9%vs 87.7%，χ2=3.7，P ＜0.05)。5 μg/ml與 10 μg/ml和20 μg/ml比較，SFC數(shù)量和敏感度均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)，因此確定抗原 K6刺激濃度為5 μg/ml。

2.1.3 抗原K6診斷敏感度和特異度 抗原K6診斷敏感度為80.0%(68/85)。T-SPOT.TB試劑盒敏感度是抗原A或抗原B診斷陽性(抗原A/B敏感度)，抗原A/B診斷敏感度為85.9%(73/85，表1);抗原K6與抗原A/B敏感度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.04，P=0.31)?？乖瑼和抗原B敏感度分別為78.8%(67/85)和72.9%(62/85)，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.88，P=0.35)?？乖璌6特異度為83.9%(47/56)，抗原 A/B特異度為73.2%(41/56，表2)?？乖璌6與抗原A/B特異度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.93，P=0.17)。抗原A和抗原B特異度分別為82.1%(46/56)和73.2%(41/56)，兩者比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.29，P=0.26)。

抗原K6、抗原A/B作為刺激原的IFN-γ ELISPOT診斷結(jié)核病的陽性預(yù)示值分別為88.3%(68/77)和82.9%(73/88)，陰性預(yù)示值分別為73.4%(47/64)和77.3%(41/53)。

2.1.4 抗原K6與T-SPOT.TB診斷相關(guān)性分析結(jié)核病組，抗原K6與抗原 A診斷一致性較高(94.2%，Kappa=0.82)，與抗原A/B診斷一致性較高(91.7%，Kappa=0.711)，但與抗原B診斷一致性較低(81.4%，Kappa=0.481)。非結(jié)核性肺部相關(guān)疾病組，抗原 K6與抗原 A診斷一致性較高(96.4%，Kappa=0.867)，與抗原A/B診斷一致性較高(89.3%，Kappa=0.682)，而與抗原B診斷一致性稍低(85.7%，Kappa=0.593)。

2.2 抗原K6刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數(shù)量

結(jié)核病組，20個患者PBMC經(jīng)抗原B刺激分泌IFN-γ的SFC數(shù)量超過100個，而只有7個患者PBMC經(jīng)抗原A或抗原K6刺激分泌IFN-γ的SFC數(shù)量超過100個(圖2)。同一抗原刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數(shù)量，結(jié)核病組普遍高于非結(jié)核性肺部相關(guān)疾病組(圖2)。

結(jié)核病組，抗原 B刺激 PBMC分泌 IFN-γ的SFC數(shù)量(平均為77個)分別高于抗原A和抗原K6刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數(shù)量(平均為46個和43個)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011和P=0.004);抗原A和抗原K6刺激PBMC分泌 IFN-γ的SFC數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.732)。非結(jié)核性肺部相關(guān)疾病組，抗原B刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數(shù)量(平均為9個)分別與抗原A和抗原K6刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數(shù)量(平均數(shù)為14個和13個)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.592和P=0.609);抗原A和抗原K6刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

(P=0.983)。

圖1 ELISPOT檢測特異抗原刺激PBMC分泌IFN-γ的SFCFig.1 Spot forming cells secreting IFN-γ of peripheral blood mononuclear cell stimulated by specific antigen

表1 結(jié)核病患者IFN-γ ELISPOT檢測結(jié)果Tab.1 The results of IFN-γ ELISPOT for tuberculosis patients

表2 非結(jié)核肺部相關(guān)疾病患者ELISPOT檢測結(jié)果Tab.2 The results of IFN-γ ELISPOT for nontuberculous pulmonary disease

圖2 不同抗原刺激分泌IFN-γ的SFC數(shù)量散點(diǎn)圖Fig.2 Scatter plots of spot forming cells secreting IFN-γ stimulated by specific antigen of Mycobacterium tuberculosis

結(jié)核組，抗原K6和抗原A刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.856，P=0.000)，抗原K6和抗原B刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.234，P=0.024)，抗原A和抗原B刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.304，P=0.003)。非結(jié)核性肺部相關(guān)疾病組，抗原K6和抗原A刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.982，P=0.000)，抗原K6和抗原B刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.611，P=0.000)，抗原A和抗原B刺激PBMC分泌IFN-γ的SFC數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.586，P=0.000)。

3 討論

IGA是目前公認(rèn)用于結(jié)核分枝桿菌感染篩查優(yōu)于TST的一種細(xì)胞學(xué)診斷方法。本文采用T-SPOT.TB試劑盒中預(yù)包被板和顯色試劑及自研制的抗原K6作為刺激原建立IFN-γ ELISPOT，該方法用于新入院結(jié)核病患者診斷敏感度和特異度分別為80.0%和 83.9%，與 T-SPOT.TB診斷敏感度(85.9%)和特異度(73.2%)相當(dāng);也與文獻(xiàn)報道TSPOT.TB與自研制RD1區(qū)抗原ELISPOT診斷初治肺結(jié)核敏感度(分別為89.7%和79.3%)相當(dāng)，肺結(jié)核化療未影響T-SPOT.TB診斷敏感度(87.5%)，但顯著降低自研制RD1區(qū)抗原ELISPOT診斷敏感度(25%)［6］。K6 刺激PBMC分泌IFN-γ是否受化療影響需進(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)核IGA還可用于肺外結(jié)核輔助診斷，如結(jié)核性胸膜炎、骨結(jié)核等［7，8］;同時還可用于結(jié)核病疫苗評價［9，10］。K6 抗原 IFN-γ ELISPOT也可用于肺外結(jié)核診斷，但本研究納入的肺外結(jié)核病例較少，因此與肺結(jié)核合并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

T-SPOT.TB與QFT-IT檢測一般采用外周血，但也可采用感染部位細(xì)胞。結(jié)核性胸膜炎患者，外周血和胸水QFT-IT診斷敏感度和特異度均相當(dāng)［7］。另報道結(jié)核性胸膜炎患者胸水單核細(xì)胞ELISPOT檢測獲得滿意結(jié)果，敏感度達(dá)到92.5%、特異度為80.0%［11］。但是除了胸水、腦積液等，其他感染部位單核細(xì)胞很難獲得，因此，外周血是結(jié)核IGA檢測最主要的標(biāo)本來源。

結(jié)核IGA和TST均反映機(jī)體細(xì)胞免疫狀態(tài)，研究發(fā)現(xiàn)HIV、系統(tǒng)紅斑狼瘡(SLE)等原因引起機(jī)體免疫功能降低到一定限度才影響結(jié)核IGA檢測。結(jié)核病合并HIV感染不影響結(jié)核IGA檢測，因?yàn)門SPOT.TB分別用于HIV感染者和HIV非感染者檢測結(jié)核分枝桿菌感染診斷，其一致性很高［12］。但HIV感染者CD4數(shù)量小于200時，T-SPOT.TB和QFT-IT檢測結(jié)核分枝桿菌感染敏感度低于5%;但當(dāng)HIV感染者CD4數(shù)量大于200時，T-SPOT.TB和QFT-IT檢測敏感度恢復(fù)正常，分別為10.9%和9.1%;此時TST檢測敏感度為16.4%［13］。TST反映大于10 mm的SLE患者，TST與QFT-IT診斷一致性很高［14］。

T-SPOT.TB和QFT-IT均不能區(qū)分活動性結(jié)核病與結(jié)核分枝桿菌感染，研制診斷活動性結(jié)核病的試劑盒顯得十分必要。一方面篩選新刺激抗原、一方面尋找新細(xì)胞因子標(biāo)識［15］。研究發(fā)現(xiàn)Rv1985c可區(qū)分結(jié)核病患者、結(jié)核分枝桿菌潛伏感染者同BCG接種者，Rv1985c與ESAT-6、CFP-10聯(lián)合可提高診斷敏感度、不降低特異度［16，17］。Rv2629、Rv1009和 Rv2389c是IFN-γ分泌的強(qiáng)免疫刺激原，而Rv0574c、Rv2630、Rv1998 和 Rv054c是 IL-8、IL-6和IL-17分泌的強(qiáng)免疫刺激原［18］。比較ESAT-6、CFP10、Rv2031c、Rv2654c和 Rv1038c的重疊肽體外刺激效果發(fā)現(xiàn)CFP10最好，其次是ESAT-6、Rv2031c和 Rv1038c 居中，Rv2654c 無刺激活性［19］。IFN-γ ELISA 表明 Rv0867c、Rv2389c、Rv2450c、Rv1009 和Rv1884c 可診斷活動性結(jié)核?。?0］。IFN-γ ELISPOT表明Rv3873、Rv3878和Rv3879c可用于潛伏感染向活動性結(jié)核進(jìn)展的檢測［21］。肺結(jié)核患者支氣管灌洗液分泌Rv2628特異的IFN-γ CD4+T細(xì)胞顯著高于PBMC，但其反應(yīng)強(qiáng)度低于RD1抗原［22］。ESAT-6的三個肽刺激效果好于CFP-10的C14多肽(52～65氨基酸)［23］。我們結(jié)果表明 K6刺激 PBMC分泌IFN-γ的強(qiáng)度低于抗原B(CFP-10多肽)、與抗原A相當(dāng)，但三種抗原診斷敏感度比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

抗原K6可作為IFN-γ ELISPOT候選抗原之一，將進(jìn)一步評價抗原K6區(qū)分活動性結(jié)核與結(jié)核分枝桿菌潛伏感染、結(jié)核分枝桿菌感染與BCG接種的應(yīng)用價值。

1 孫 勇，洪 峰，許紹發(fā)et al.結(jié)核分枝桿菌thy A基因突變與對氨基酸水楊酸鈉耐藥關(guān)系的研究［J］.中國防癆雜志，2012;34(6):350-353.

2 Lienhardt C，Glaziou P，Uplekar M et al.Global tuberculosis control:lessons learnt and future prospects［J］.Nat Rev Microbiol，2012;10(6):407-416.

3 中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核分學(xué)會.肺結(jié)核診斷和治療指南［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2001;24(2):70-74.

4 Santín Cerezales M，Benítez J D.Diagnosis of tuberculosis infection using interferon-γ-based assays［J］.Enferm Infecc Microbiol Clin，2011;29(Suppl 1):26-33.

5 Abramo C，Meijgaarden K E，Garcia D et al.Monokine induced by interferon gamma and IFN-γ response to a fusion protein of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and CFP-10 in Brazilian tuberculosis patients［J］.Microbes Infect，2006;8(1):45-51.

6 Latorre I，Altet N，de Souza-Galva? M et al.Specific Mycobacterium tuberculosis T cell responses to RD1-selected peptides for the monitoring of anti-tuberculosis therapy［J］.Scand J Infect Dis，2012;44(3):161-167.

7 Losi M，Bocchino M，Matarese A et al.Role of the quantiferon-TB test in ruling out pleural tuberculosis:a multi-centre study［J］.Int J Immunopathol Pharmacol，2011;24(1):159-165.

8 Cho O H，Park S J，Park K H et al.Diagnostic usefulness of a T-cell-based assay for osteoarticular tuberculosis［J］.J Infect，2010;61(3):228-234.

9 王 鵬，徐 苗，陳保文et al.結(jié)核復(fù)合抗原疫苗不同抗原組合對小鼠免疫功能的影響［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2011;34(4):269-273.

10 Scriba T J，Tameris M，Mansoor N et al.Dose-finding study of the novel tuberculosis vaccine，MVA85A，in healthy BCG-vaccinated infants［J］.J Infect Dis，2011;203(12):1832-1843.

11 杜鳳嬌，戈啟萍，韋攀健et al.酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)術(shù)和流式細(xì)胞術(shù)檢測γ干擾素對結(jié)核性胸膜炎的輔助診斷價值［J］.中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2011;34(7):617-622.

12 Zhang M，Wang H，Liao M et al.Diagnosis of latent tuberculosis infection in bacille Calmette-Guérin vaccinated subjects in China by interferon-gamma ELISpot assay［J］.Int J Tuberc Lung Dis，2010;14(12):1556-1563.

13 Latorre I，Martínez-Lacasa X，F(xiàn)ont R et al.IFN-γ response on T-cell based assays in HIV-infected patients for detection of tuberculosis infection［J］.BMC Infect Dis，2010;10(10):348-354.

14 Yilmaz N，Zehra Aydin S，Inanc N et al.Comparison of QuantiFERON-TB Gold test and tuberculin skin test for the identification of latent Mycobacterium tuberculosis infection in lupus patients［J］.Lupus，2012;21(5):491-495.

15 Kellar K L，Gehrke J，Weis S E et al.Multiple cytokines are released when blood from patients with tuberculosis is stimulated with Mycobacterium tuberculosis antigens［J］.PLoS One，2011;6(11):e26545.

16 Chen J，Wang S，Zhang Y et al.Rv1985c，a promising novel antigen for diagnosis of tuberculosis infection from BCG-vaccinated controls［J］.BMC Infect Dis，2010;17(10):273-282.

17 Wang S，Chen J，Zhang Y et al.Mycobacterium tuberculosis RD2 and RD11 antigens Rv1985c and Rv3425 have the promising potential to distinguish active tuberculosis patients from BCG vaccinated individuals［J］.Clin Vaccine Immunol，2013;20(1):69-76.

18 Kassa D，Ran L，Geberemeskel W et al.Analysis of immune responses against a wide range of Mycobacterium tuberculosis antigens in active pulmonary tuberculosis patients［J］.Clin Vaccine Immunol，2012;19(12):1907-1915.

19 Arlehamn C S，Sidney J，Henderson R et al.Dissecting mechanisms of immunodominance to the common tuberculosis antigens ESAT-6，CFP10，Rv2031c(hspX)，Rv2654c(TB7.7)，and Rv1038c(EsxJ)［J］.J Immunol，2012;188(10):5020-5031.

20 Chegou N N，Black G F，Loxton A G et al.Potential of novel Mycobacterium tuberculosis infection phase-dependent antigens in the diagnosis of TB disease in a high burden setting［J］.BMC Infect Dis，2012;doi:10.1186/1471-2334-12-10.

21 Dosanjh D P，Bakir M，Millington K A et al.Novel M tuberculosis antigen-specific T-cells are early markers of infection and disease progression［J］.PLoS One，2011;6(12):e28754.

22 Chiacchio T，Petruccioli E，Vanini V et al.Higher frequency of T-cell response to M.tuberculosis latency antigen Rv2628 at the site of active tuberculosis disease than in peripheral blood［J］.PLoS One，2011;6(11):e27539.

23 Yang F F，Tu Z Q，F(xiàn)ang Y M et al.Monitoring of peptide-specific and gamma interferon-productive T cells in patients with active and convalescent tuberculosis using an enzyme-linked immunosorbent spot assay［J］.Clin Vaccine Immunol，2012;19(3):401-410.