高通量測(cè)序技術(shù)分析肺結(jié)核患者PBMC基因表達(dá)譜差異①

魏 晶 張晨晨 張國(guó)良 張明霞 陳心春 孟志忠

(華南理工大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣州510006)

據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)統(tǒng)計(jì)，全球約有1/3的 人感染了結(jié)核桿菌，每年新發(fā)感染人數(shù)約800萬(wàn)，每年因結(jié)核病而死亡的人數(shù)更高達(dá)200萬(wàn)［1］。我國(guó)結(jié)核桿菌的感染率為44.5%，活動(dòng)性肺結(jié)核患者451萬(wàn)，每年死亡人數(shù)達(dá)13萬(wàn)，加上目前人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV)感染的流行，結(jié)核桿菌耐藥菌株的出現(xiàn)，導(dǎo)致結(jié)核病疫情急劇惡化，并且機(jī)體在感染肺結(jié)核后，對(duì)病原體免疫的控制和防護(hù)的具體途徑和機(jī)制知之甚少［2，3］。人類(lèi)對(duì)于疾病的認(rèn)識(shí)最終是建立在對(duì)基因組及其功能的全面理解的基礎(chǔ)上［4］，新一代高通量測(cè)序技術(shù)有助于從基因水平對(duì)疾病進(jìn)行研究，并在各個(gè)領(lǐng)域如癌癥、HIV、肝病等都取得了較好效果［5-8］。因此本研究采用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)肺結(jié)核患者的mRNA表達(dá)譜進(jìn)行分析，以期找到用于肺結(jié)核診斷的特異性標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 病人和標(biāo)本收集 參照中國(guó)衛(wèi)生部《結(jié)核病臨床診療指南》，在深圳市第三人民醫(yī)院收集10例肺結(jié)核患者［男女各5例，年齡(22.1±5.13)歲］的全血20 ml，所有進(jìn)行結(jié)核菌特異性IFN-Υ ELISPOT檢測(cè)斑點(diǎn)數(shù)＞30個(gè)，無(wú)合并慢性疾病與自身免疫疾?。?］。健康對(duì)照組10例［男女各5例，年齡(23.7±5.10)歲］均來(lái)自深圳市第三人民醫(yī)院體檢人員。

1.2 外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離和RNA的提取 本研究采用了Ficoll-hypaque(葡聚糖－泛影葡胺)密度梯度離心法分離全血中的PBMC(確保細(xì)胞濃度為106ml－1)，并用Trizol法提取PBMC中的RNA，用NanoDrop 2000分光光度計(jì)測(cè)總RNA的濃度/純度，瓊脂糖凝膠變性電泳檢測(cè)RNA的完整性。

1.3 cDNA文庫(kù)的構(gòu)建和確立及Illumina高通量測(cè)序 等量混合10例肺結(jié)核患者RNA組成RNA池，健康人群RNA也采取同樣的處理方法，按照標(biāo)準(zhǔn)的Illumina 1.5說(shuō)明書(shū)構(gòu)建cDNA文庫(kù)。首先用Poly(T)寡聚核苷酸從總RNA中抽取全部帶Poly(A)尾的mRNA，將所得的mRNA隨機(jī)打斷成片段，再用隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶從mRNA片段合成cDNA片段。然后，對(duì)cDNA片段進(jìn)行末端修復(fù)并連接測(cè)序接頭，得到將用于測(cè)序的cDNA。為了提高測(cè)序效率，本實(shí)驗(yàn)還用電泳切膠法獲取長(zhǎng)度范圍在200 bp(±25 bp)的cDNA片段，再通過(guò) PCR擴(kuò)增，得到最終的cDNA文庫(kù)。將所得的cDNA文庫(kù)加入流動(dòng)槽中的各通道中，經(jīng)過(guò)橋式 PCR擴(kuò)增后，用Illumina Genome Analyzer IIx測(cè)序。

1.4 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)的標(biāo)簽(tag)分析，基因表達(dá)量的標(biāo)準(zhǔn)化 測(cè)序后得到的是帶有3'接頭的原始序列數(shù)據(jù)，含有各種雜質(zhì)以及少量低質(zhì)量標(biāo)簽，去除一系列包含N和拷貝數(shù)小于2的標(biāo)簽后，得到高質(zhì)量標(biāo)簽(Clean_Tag)。將Clean_Tag與人類(lèi)參考基因hg18比對(duì)，取錯(cuò)配數(shù)小于2并唯一比對(duì)的基因作為進(jìn)一步分析的基因。為了準(zhǔn)確、科學(xué)地衡量每個(gè)基因的表達(dá)水平，對(duì)每個(gè)基因表達(dá)量做標(biāo)準(zhǔn)化處理，標(biāo)準(zhǔn)化結(jié)果用TPM(transcript per million clean tags)表示［10］。

1.5 差異表達(dá)基因的篩選 參照文獻(xiàn)［11］報(bào)道的方法，采用嚴(yán)格的算法篩選兩樣本間差異表達(dá)的基因，并對(duì)差異檢驗(yàn)的P值進(jìn)行多重假設(shè)檢驗(yàn)校正，然后通過(guò)控制FDR(false discovery rate)假陽(yáng)性率來(lái)最終決定P的閾值［12］。本研究差異表達(dá)基因定義為“FDR≤0.001”且差異倍數(shù)2倍以上(即 |log2 Ratio|≥1)的基因。

1.6 Go功能富集分析與KEGG Pathway顯著性富集分析 對(duì)于差異表達(dá)的基因進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)分析，確定差異表達(dá)基因的功能，對(duì)P值矯正，滿(mǎn)足矯正P值≤0.05的GO條目被認(rèn)為是顯著性富集的條目。對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG Pathway分析，其目的在于確定不同樣本間差異表達(dá)的基因所參與的最主要代謝途徑和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

2 結(jié)果

2.1 整體分析高通量測(cè)序數(shù)據(jù) 為了解肺結(jié)核患者體內(nèi)基因表達(dá)的情況，我們構(gòu)建了2個(gè)cDNA文庫(kù):肺結(jié)核PBMC文庫(kù)和正常對(duì)照組PBMC文庫(kù)，然后將其用Illumina GAIIx高通量測(cè)序技術(shù)測(cè)序。對(duì)于肺結(jié)核樣本，測(cè)序后產(chǎn)生的原始標(biāo)簽(raw tags為3839500，對(duì)應(yīng)的標(biāo)簽種數(shù)(distinct tags)為293077類(lèi)，過(guò)濾掉拷貝數(shù)小于2和包含N的tag，還剩下3651827個(gè)107200類(lèi)高質(zhì)量標(biāo)簽(clean_tag)，將clean_tag與人類(lèi)參考基因組的明確的tag比較，只取唯一定位到參考序列，并且錯(cuò)配數(shù)小于2的tag，最后得到2430312個(gè)36390類(lèi)tag，基因數(shù)為12270個(gè)。我們所用的人類(lèi)參考基因?yàn)閔g18(NCBI Build 36.1)，其基因數(shù)30456，明確的 tag數(shù) 275988，占總tag數(shù)的92.61%。正常對(duì)照組最后產(chǎn)生了12244個(gè)基因，其他的數(shù)據(jù)如表1所示。

表1 肺結(jié)核和正常對(duì)照樣本中序列標(biāo)簽分布一覽表Tab.1 The distribution list of Tuberculosis and health control samples sequencing tags

圖1 肺結(jié)核PBMC與正常對(duì)照PBMC基因表達(dá)水平的比較Fig.1 Gene expression level A_PBMC vs B_PBMC

2.2 差異基因的篩選 將唯一比對(duì)上人類(lèi)參考序列的基因表達(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化后篩選肺結(jié)核和正常對(duì)照差異表達(dá)的基因(圖1)。取A_PBMC/B_PBMC比值的log2值，并篩選倍數(shù)≤－1(指在A_PBMC樣本中表達(dá)量低)，倍數(shù)≥1(指在A_PBMC樣本中表達(dá)量低)，F(xiàn)DR＜0.001的基因，最終篩選出了3 097個(gè)基因，其中A_PBMC＞B_PBMC(上調(diào))的基因1 601個(gè)，A_PBMC＜B_PBMC(下調(diào))的基因1 469個(gè)。將log2 Ratio值進(jìn)一步增大篩選標(biāo)準(zhǔn)至4倍，上調(diào)的基因數(shù)為74個(gè)，下調(diào)的基因數(shù)為269個(gè)。再對(duì)上調(diào)的基因控制A_PBMC的表達(dá)量＞20，篩選出了16個(gè)差異極其顯著的基因，鑒于下調(diào)的基因數(shù)較多并且B_PBMC的表達(dá)量范圍分布較廣(圖2)，因此篩選了17個(gè)表達(dá)量大于300的基因作為差異極顯著的基因(表2)

圖2 269個(gè)下調(diào)基因的表達(dá)量分布Fig.2 The expression distribution of 269 down-regulation genes

表2 差異極顯著基因Tab.2 The significant difference genes

表3 差異表達(dá)的基因KEGG通路分析Tab.3 The KEGG pathway analysis of different expression genes

圖3 差異基因GO功能富集分析結(jié)果Fig.3 The results of differences genes GO function enrichment analysis

2.3 差異基因的GO功能富集分析 本研究將篩選出的差異基因進(jìn)行了一些列的GO功能富集性分析，包括細(xì)胞組成分析(Cellular component)、分子功能分析(Molecular function)、生物過(guò)程分析(Biological process)。在進(jìn)行P值矯正后，取P小于0.05的GO分類(lèi)條目(term)，如表2、圖3所示。

2.4 差異基因KEGG代謝通路分析 篩選出差異基因后，為進(jìn)一步分析這些差異基因在哪些代謝通路中發(fā)揮作用，因此我們又做了KEGG代謝通路分析，3097個(gè)差異基因能注釋到通路中的基因?yàn)?508個(gè)(人類(lèi)所有的基因能注釋到KEGG通路中的基因數(shù)為9424個(gè))取 P值小于0.01，Q值小于0.05的代謝通路作為顯著富集的通路，注釋到通路中的差異基因數(shù)量較多的通路如表3所示。

3 討論

高通量測(cè)序技術(shù)的迅猛發(fā)展，以及與疾病診斷的加速結(jié)合，使得疾病的研究模式發(fā)生了重大的轉(zhuǎn)變。以數(shù)據(jù)化為導(dǎo)向，大規(guī)模，工業(yè)化的研究模式，極大的提高了疾病的研究效率，革新了人們對(duì)于疾病的認(rèn)識(shí)，為疾病的研究，診斷，預(yù)防及治療提供了更為有效的手段。正如科學(xué)家預(yù)言:使用DNA測(cè)序，可以再現(xiàn)致命疾病(肺結(jié)核)，從人到人的傳播過(guò)程，快速的識(shí)別病原體的來(lái)源和活動(dòng)。這個(gè)方法直接向公眾宣告了控制感染性疾病暴發(fā)流行的新的健康策略。同樣本研究也寄希望通過(guò)新一代的測(cè)序技術(shù)，能夠找到與肺結(jié)核疾病發(fā)生相關(guān)的基因，為后續(xù)的臨床研究奠定基礎(chǔ)。

本研究中肺結(jié)核和健康對(duì)照樣本經(jīng)測(cè)序比對(duì)到參考基因上后，檢測(cè)到的基因總數(shù)分別為12 270，12 244，即存在一部分基因僅在肺結(jié)核或者正常樣本中表達(dá)，如僅在肺結(jié)核表達(dá)的基因包括(表達(dá)量):DEFA4(29.57)、AKR7A2(18.62)、SLC16A6(10.68)、ADRA2B(10.68)、DNAH12(3.56)等，僅在正常樣本表達(dá)的基因包括(表達(dá)量):LOC100286895(103.82)、RASAL2(42)、PMFBP1(31.79)、CYTH3(31.21)、RNF148(29.46)、THAP8(3.5)、CLIC5(3.5)等。如果這些基因被鑒定證實(shí)只在肺結(jié)核或正常對(duì)照中表達(dá)，那么這些基因就可被用作肺結(jié)核的臨床診斷標(biāo)識(shí)。同時(shí)造成這種結(jié)果的還有一種可能性是某些基因的表達(dá)量很低，加上檢測(cè)靈敏度或樣品濃度不夠，可能檢測(cè)不出來(lái)。

以 FDR≤0.001，|log2 Ratio|≥1為標(biāo)準(zhǔn)篩選出了3097個(gè)差異基因，當(dāng)將篩選的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步縮小，設(shè)定|log2 Ratio|≥4時(shí)，發(fā)現(xiàn)有16個(gè)基因明顯明顯上調(diào)(表2)。其中OSM基因與已經(jīng)報(bào)道的結(jié)果相反［13］。IL-15具有與 IL-2相似的作用，可促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖分化，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子的分泌，對(duì)結(jié)核患者的保護(hù)性免疫機(jī)制［14］。其他上調(diào)的基因目前沒(méi)有與肺結(jié)核相關(guān)的報(bào)道，因此關(guān)于上調(diào)的原因有待于進(jìn)一步研究。下調(diào)的基因269個(gè)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于上調(diào)的基因，并且其表達(dá)量的分布范圍也很廣泛(圖1、2)，即可能機(jī)體在感染了肺結(jié)核以后，大部分基因的表達(dá)被抑制，以至于表達(dá)量大幅度下降。在肺結(jié)核患者中本應(yīng)正常起作用的基因被抑制，那么很大程度上會(huì)對(duì)機(jī)體的正常代謝造成紊亂，甚至損傷。如果通過(guò)一定的手段提高這些基因的表達(dá)量，是否會(huì)提高機(jī)體的免疫力，有利于治療肺結(jié)核，還有待于更深入的研究。在正常對(duì)照中表達(dá)量最高的三個(gè)基因分別為 CXCR4、TWIST2、TYROBP，除了 CXCR4在結(jié)核領(lǐng)域研究較多外［15］，其他兩個(gè)基因目前并沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道，鑒于這三個(gè)基因差異極大，很有可能作為候選的診斷標(biāo)識(shí)。

在對(duì)差異基因進(jìn)行GO功能富集性分析時(shí)，發(fā)現(xiàn)差異基因主要位于細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞內(nèi)相關(guān)的細(xì)胞器，細(xì)胞質(zhì)等，主要起著鏈接功能，如蛋白質(zhì)連接、RNA連接、酶連接、核苷酸連接等，也具有催化活性，少數(shù)基因是核糖體的結(jié)構(gòu)組成部分，與甲狀腺受體結(jié)合，在代謝過(guò)程中起作用，包括細(xì)胞內(nèi)代謝、初級(jí)代謝、高分子代謝、生物高聚物代謝，還在胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)中起作用等。每一個(gè)GO功能相關(guān)的上調(diào)基因數(shù)基本上多于下調(diào)的基因數(shù)，有可能在肺結(jié)核患者中上調(diào)的基因起主要的影響作用。同時(shí)這些差異基因也主要在MAPK信號(hào)通路、趨化因子信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等通路中起作用，也與亨廷頓氏舞蹈病、老年癡呆癥、帕金森氏病等疾病發(fā)生相關(guān)。值得一提的是有72個(gè)差異基因與癌癥的通路(Qvalue=0.0725)有關(guān)，當(dāng)今肺結(jié)核合并肺癌的患者越來(lái)越多［16］，對(duì)癌癥通路的分析有助于了解肺結(jié)核導(dǎo)致肺癌的發(fā)生機(jī)制。

因?yàn)楦咄可疃葴y(cè)序的結(jié)果需要進(jìn)一步的驗(yàn)證，如qPCR，但是因?yàn)闃颖竞徒?jīng)費(fèi)的原因，未能驗(yàn)證，并且差異基因的相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚不清楚，國(guó)內(nèi)也沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道，有待于更深入的研究，但是，我相信本研究所篩選出來(lái)的差異基因能為肺結(jié)核領(lǐng)域篩選診斷標(biāo)識(shí)基因，藥物作用的靶點(diǎn)等提供參考。

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