大豆皂甙對糖尿病大鼠血、尿及腎臟IL-6影響的實驗研究①

宋 宇 石 博 李冬梅 黃可欣

(吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院形態(tài)學(xué)中心，長春130021)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病的主要并發(fā)癥，臨床上30%～50%的糖尿病患者合并DN，其病理主要表現(xiàn)為系膜區(qū)的膨脹，基底膜的增厚以及出入球小動脈硬化及腎小管的肥大、變性［1］。病變早期可通過腎小球增生而代償，但隨著病變的進(jìn)一步加重會進(jìn)入到失代償期，而影響到血流動力學(xué)及腎小球濾過率，最終影響腎功能［2］。DN的發(fā)病機制復(fù)雜多樣，尚未完全闡明，這也就給DN的治療帶來了極大的困難。本研究室的前期研究證實［3］，大豆皂甙能夠降低血糖水平及升高胰島素水平，對糖尿病的治療有一定的療效。目前，大量研究表明炎癥反應(yīng)因子IL-6與DN的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［4］，但大豆皂甙對糖尿病大鼠炎癥反應(yīng)因子IL-6的作用尚無研究報道。本實驗旨在通過探討大豆皂甙對糖尿病大鼠血、尿及腎臟IL-6的影響，揭示大豆皂甙對糖尿病大鼠腎臟有一定保護(hù)作用，IL-6可能參與了糖尿病腎病的發(fā)病及病理變化過程，可能作為判斷糖尿病預(yù)后及指導(dǎo)治療的指標(biāo)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 健康雄性Wistar大鼠45只，體質(zhì)量為(210±20)克，由吉林省藥品檢驗所提供(動物合格證號960101032);隨機取10只動物做正常對照組，造模35只，將造模成功的30只動物隨機分為糖尿病對照組(15只)、大豆皂甙給藥組(15只)，在實驗過程中糖尿病對照組動物死亡4只，大豆皂甙給藥組死亡1只。

1.2 主要試劑及儀器 大豆皂甙(SS)由吉林省中醫(yī)中藥研究所提供;實驗用大豆皂甙用生理鹽水稀釋;鏈脲佐菌素(STZ)購于Sigma公司;ELISA試劑盒購于南京建成生物有限公司;一抗IL-6購自Santa Crus公司，二抗、三抗和DAB顯色試劑盒購于福州邁新生物有限公司;Trizol、RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑、dNTP購于北京鼎國生物有限公司;實時熒光定量PCR儀購于美國MJ Research公司。

1.3 動物模型制備及給藥 隨機選取實驗動物35只，稱量體重后，腹腔注射STZ(用新配制的枸櫞酸緩沖液溶解，10 mg/ml)50 mg/kg;48小時后采尾血測空腹血糖，濃度大于16.7 mmol/L為模型復(fù)制成功。造模成功后正常對照組、糖尿病模型組和大豆皂甙給藥組分別每日清晨給予灌胃，對照組灌胃生理鹽水、糖尿病模型組灌胃生理鹽水和大豆皂甙給藥組灌胃大豆皂甙(10 mg/kg)，連續(xù)3個月。

1.4 標(biāo)本采集 動物處死前一天用代謝籠收集24小時尿液，－70℃冰箱凍存，待測。第二天清晨摘取眼球取血，然后迅速處死取出腎臟，左腎凍存用于腎組織IL-6 mRNA及蛋白的測定，右腎固定于10%中性福爾馬林液中，每組取10個腎臟，常規(guī)石蠟包埋，切成5微米切片2張，分別進(jìn)行HE和免疫組化染色。

1.5 指標(biāo)檢測

1.5.1 血、尿和腎臟IL-6蛋白的檢測 血、尿及腎臟組織經(jīng)勻漿后取上清液，酶聯(lián)免疫吸附法檢測IL-6，具體步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.5.2 腎臟IL-6mRNA水平的檢測 腎臟用Trizol提取腎臟組織總RNA，反轉(zhuǎn)錄后行實時熒光定量PCR檢測 IL-6 mRNA水平;β-actin:上游引物，5'-AGGGAAATCGTGCGTGACATTAAA-3'，下游引物5'-ACTCATCGTACTCCTGCTTGCTGA-3'，產(chǎn)物 690 bp;IL-6:上游引物，5'-TGGAGTCACAGAAGGAGTGGCTAAG-3'，下 游 引 物 5'-TCTGACCACAGTGAGGAATGTCCAC-3'，產(chǎn)物155 bp。凝膠成像后用凝膠圖像分析系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.5.3 腎組織的病理檢測 采用HE染色法檢測。

1.5.4 腎組織的IL-6半定量蛋白檢測 采用SP免疫組織化學(xué)方法檢測。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)均以±s表示，采用 t檢驗，檢驗標(biāo)準(zhǔn)α =0.05。

2 結(jié)果

對照組大鼠體重明顯增加，精神狀態(tài)好，毛皮有光澤，反應(yīng)靈敏。糖尿病組大鼠明顯消瘦，精神萎靡，毛皮無光澤，反應(yīng)遲鈍。大豆皂甙治療組大鼠體重、精神狀態(tài)、毛皮光澤和反應(yīng)度較對照組差，但明顯好于糖尿病組。

2.1 各組血、尿和腎臟IL-6蛋白水平的比較 糖尿病模型組大鼠血、尿和腎臟IL-6蛋白水平明顯高于對照組和SS給藥組(P＜0.01)，SS給藥組略高于對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);見表1。

2.2 各組腎臟IL-6 mRNA水平的比較 糖尿病模型組大鼠腎臟IL-6 mRNA水平明顯高于對照組和SS給藥組(P＜0.01)，SS給藥組略高于對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);見表2及圖1。

2.3 各組腎組織的IL-6半定量蛋白的比較 免疫組化染色顯示，陽性表達(dá)于腎小管細(xì)胞質(zhì)中，棕黃色為免疫組化陽性物質(zhì)見圖2;糖尿病模型組大鼠腎臟IL-6染色陽性強度明顯高于對照組和SS給藥組(P＜0.01)，SS給藥組略高于對照組無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05);見表2。

2.4 各組腎臟病理改變的比較 HE染色:顯示正常組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰，腎小管形狀規(guī)則，腎小管上皮細(xì)胞染色均勻;SS給藥組大鼠腎臟結(jié)構(gòu)清晰，腎小管形狀較為規(guī)則，可見少量腎小管上皮細(xì)胞變性;模型組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)不清晰，腎小球、腎小管形狀較規(guī)則但有腎小管上皮細(xì)胞變性;見圖3。

表1 各組血、尿和腎臟IL-6蛋白水平的比較(n=10，±s)Tab.1 Comparision of IL-6 protein in blood，urine and kidney(n=10，±s)

表1 各組血、尿和腎臟IL-6蛋白水平的比較(n=10，±s)Tab.1 Comparision of IL-6 protein in blood，urine and kidney(n=10，±s)

Note:1)P ＜0.01，compared with control group and SS treatment;2)P ＞0.05 compared with control group.

Groups Control Diabetic model SS treatment Blood IL-6(ng/L) 0.83 ±0.16 3.24 ±0.491) 0.91 ±0.332)Urine IL-6(ng/L) 0.62 ±0.15 2.84 ±0.371) 0.69 ±0.182)Kidney IL-6(ng/L)1.26 ±0.61 4.48 ±1.021) 1.38 ±0.822)

圖1 RT-PCR分析IL-6 mRNA的表達(dá)Fig.1 RT-PCR analysis of the expression of IL-6 mRNA

表2 各組腎臟IL-6 mRNA及蛋白灰度值水平的比較(n=10，±s)Tab.2 Comparision of IL-6 mRNA and protein gray value in kidney(n=10，±s)

表2 各組腎臟IL-6 mRNA及蛋白灰度值水平的比較(n=10，±s)Tab.2 Comparision of IL-6 mRNA and protein gray value in kidney(n=10，±s)

Note:1)P ＜0.01 compared with control group and SS treatment;2)P ＞0.05 compared with control group.

Groups Control Diabetic model SS treatment IL-6 mRNA 1.07 ±0.34 2.86 ±0.411) 0.98 ±0.142)IL-6 protein(gray value) 156.21 ±4.87 93.46 ±4.151)148.66 ±3.922)

圖2 腎組織中IL-6的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)Fig.2 IL-6 expression in kidney tissue(Immunohistochemical staining，×400)

圖3 腎組織病理改變(HE染色，×400)Fig.3 Pathological changes in kidney tissue(HE staining，×400)

3 討論

糖尿病腎病(DN)發(fā)病機制尚未完全清楚，其主要形態(tài)學(xué)改變是腎小球硬化，其直接原因是多種細(xì)胞外基質(zhì)成分的積聚。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，多種生長因子與細(xì)胞因子的改變與這些細(xì)胞外基質(zhì)成分的合成及代謝的調(diào)節(jié)密切相關(guān)［4，5］。

IL-6作為一種肝細(xì)胞刺激因子能在肝細(xì)胞中誘發(fā)不同的急性期蛋白，作為內(nèi)源性致熱源，是參與炎癥反應(yīng)的重要的細(xì)胞因子，它可直接作用于胰島β細(xì)胞造成其損傷，誘發(fā)胰島素抵抗，通過促使炎癥細(xì)胞因子的合成與釋放，促使細(xì)胞粘附因子的表達(dá)，促進(jìn)前列腺素E2、血小板活化因子的合成與釋放，使炎癥細(xì)胞聚集與粘附，循環(huán)微血管擴張，通透性增強，參與了腎小球組織損傷［4］;能刺激系膜細(xì)胞產(chǎn)生氧自由基，從而使過氧化脂質(zhì)代謝產(chǎn)物增多，造成細(xì)胞內(nèi)膜損傷，損傷基底膜，產(chǎn)生蛋白尿［6，7］。IL-6水平的升高，可引起腎小球濾過屏障和電荷屏障的破壞，同時損壞腎小管上皮細(xì)胞，它與系膜細(xì)胞上的IL-6受體結(jié)合，刺激腎小球系膜的增生和細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生，引起腎小球硬化癥，進(jìn)而導(dǎo)致糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展。由此形成惡性循環(huán)，促進(jìn)DM的發(fā)展及DN的發(fā)生發(fā)展。此外IL-6還是體內(nèi)許多細(xì)胞產(chǎn)生的一種具有多種生物活性的刺激因子，是機體復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)中的一個重要成員，它可能通過調(diào)節(jié)腎小球系膜細(xì)胞的有絲分裂，促進(jìn)該細(xì)胞增殖并產(chǎn)生和釋放前列腺素，引起腎小球微血管改變，在DN早期和中期腎小球濾過率增高中起作用［8，9］。本室前期研究表明，大豆皂甙能升高胰島素水平，保護(hù)胰島β細(xì)胞從而阻斷了IL-6的一系列損傷作用［3］。

綜上所述，本實驗研究結(jié)果表明，糖尿病模型組大鼠血、尿及腎組織中IL-6水平顯著地高于正常組(P＜0.01)，經(jīng)大豆皂甙干預(yù)后IL-6水平明顯降低(P＜0.01)，提示大豆皂甙對糖尿病大鼠的腎臟有一定的保護(hù)作用，說明IL-6參與糖尿病腎病的發(fā)生和發(fā)展過程，對糖尿病腎臟損害具有顯著的干預(yù)治療作用。大豆皂甙干預(yù)后IL-6水平下降其機制可能與抑制腎臟內(nèi)炎癥介質(zhì)表達(dá)有關(guān)。因此檢測糖尿病腎病患者血清中IL-6水平，對了解病情，指導(dǎo)臨床和觀察愈后均有十分重要的臨床價值。

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