神蜂精對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用

龔 雁 王金勝 程林兵 繆曉青

（福建農(nóng)林大學(xué)蜂學(xué)學(xué)院，福州 350002）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種自身免疫性疾病，其主要病癥是慢性炎癥、免疫失調(diào)和滑膜增生，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)損傷[1]。迄今為止，RA的病理機(jī)制不清。西醫(yī)治療本病常用消炎鎮(zhèn)痛類藥物和糖皮質(zhì)激素，但這些藥物大多毒副作用和不良反應(yīng)較大[2]。中醫(yī)中藥總體療效不好，且部分中藥毒副作用較大，如雷公藤等[2]。因此使用安全有效的中藥制劑治療RA具有積極意義。

神蜂精是由福建蜂療醫(yī)院院長繆曉青教授發(fā)明的中藥外用制劑，主要有效成分為蜂毒、蜂膠及乳香、九里香、穿山龍等中藥，具有消炎鎮(zhèn)痛、調(diào)節(jié)免疫、祛風(fēng)除濕、通經(jīng)散寒、行氣活血、促進(jìn)損傷組織修復(fù)等作用[3，4]。福建蜂療醫(yī)院臨床實(shí)踐證明神蜂精治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎療效顯著，且無毒副作用，但在實(shí)驗(yàn)研究方面缺乏相應(yīng)的客觀實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)以佐劑性關(guān)節(jié)炎（adjuvant arthritis，AA）大鼠為模型，觀察神蜂精對(duì)其足爪腫脹程度，免疫器官，血清中細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-4及IL-10的影響，以探討神蜂精治療RA的可能機(jī)制，評(píng)價(jià)神蜂精對(duì)AA大鼠的治療作用，為神蜂精臨床治療RA提供新的理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量150±20 g，由上海斯萊特實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)室環(huán)境：動(dòng)物分別飼養(yǎng)在籠中，室溫為23±1℃，濕度為55±5%，白天與黑夜交替各12 h。動(dòng)物自由進(jìn)食和進(jìn)水。

1.2 藥物與試劑

復(fù)方醋酸地塞米松乳膏（20 g/支，含地塞米松15 mg）：華潤三九醫(yī)藥股份有限公司；卡介苗（50 mg/支）：上海市生物制品研究所；不完全弗氏佐劑（10 ml/瓶）：美國sigma公司；神蜂精（10 ml/瓶）：福建神蜂科技有限公司。TNF-α、IL-1β、IL-4及IL-10酶聯(lián)免疫吸附試劑盒：南京建成生物研究所提供。

1.3 主要儀器

JA-2003型電子天平；0～125mm游標(biāo)卡尺；電熱恒溫水浴箱；漩渦混合儀；離心機(jī)；酶標(biāo)儀等。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 完全弗氏佐劑的配制[5]

取卡介苗50 mg，80℃水浴滅活1 h后，加入不完全弗氏佐劑10 ml，混勻，充分乳化，直至將其滴在水面上不散開為止，即為完全弗氏佐劑（Complement Freund's Adjuvant，CFA），濃度為10 mg/ml。

2.2 動(dòng)物分組

60只SD雄性大鼠，隨機(jī)分為6組，即正常組、模型組、陽性組（復(fù)方醋酸地塞米松給藥組）、低劑量神蜂精組、中低劑量神蜂精組、高劑量神蜂精組，每組10只。

2.3 AA大鼠模型的建立[6] 和給藥

取用體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇，對(duì)大鼠的右后足進(jìn)行消毒。除正常組之外，其余組的大鼠每只右后足跖皮下注射0.1 ml CFA。正常組的大鼠則注射等量的生理鹽水。設(shè)定注射當(dāng)天為第1 d。

造模14 d后，正常組大鼠不做任何處理，而對(duì)其余各組大鼠注射足進(jìn)行外部涂抹給藥。其中模型組每只大鼠涂抹0.5 ml/kg/d生理鹽水；神蜂精高、中、低劑量組每只大鼠分別涂抹1.0 ml/kg/d、0.5 ml/kg/d和0.25 ml/kg/d神蜂精；陽性組每只大鼠涂抹1.0 g/kg/d復(fù)方醋酸地塞米松乳膏。各組均連續(xù)給藥28 d。

2.4 大鼠足爪腫脹度的測定[7]

各組大鼠分別于致炎前、致炎后d15，21，27，33，39用游標(biāo)卡尺測量注射足足趾中部厚度，求出足爪腫脹度（公式如下），以觀察神蜂精對(duì)AA大鼠炎癥的影響。

2.5 大鼠外周血的采集和處理

所有大鼠于末日給藥24 h后，稱重，腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉，眼眶取血約3 ml，靜置30 min后，3000 rpm離心15 min，分離血清，-20℃保存。

2.6 胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的計(jì)算[8]

處死大鼠，無菌環(huán)境下取出脾臟和胸腺，冰生理鹽水洗凈，濾紙吸干，稱量，并計(jì)算胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)（公式如下）。

2.7 大鼠血清中TNF-α，IL-1β，IL-4及IL-10含量的測定

大鼠血清中TNF-α，IL-1β，IL-4及IL-10含量均采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測。具體步驟嚴(yán)格按相應(yīng)酶聯(lián)免疫試劑盒說明書操作。

2.8 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間差異用單因素方差分析。P<0.05定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察

正常組大鼠飲食、飲水正常，體重增加正常，毛色光澤，活動(dòng)自如。模型組大鼠精神狀態(tài)差，進(jìn)食少，體重增長緩慢，行動(dòng)遲緩、不靈活等癥狀。給予神蜂精及陽性藥物治療后，上述癥狀明顯改善。

3.2 神蜂精對(duì)AA大鼠足爪腫脹度的影響

神蜂精對(duì)AA大鼠足爪腫脹度的影響實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：給藥前（d15），與模型組相比，各組大鼠足爪腫脹度無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。給藥第6d時(shí)，與模型組相比，神蜂精高劑量組足爪腫脹度降低（P<0.05），陽性組大鼠足爪腫脹度顯著降低（P<0.01），其余組則無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；給藥第12d、18d、24d時(shí)，神蜂精高、中、低劑量組和陽性組均可明顯抑制AA大鼠足爪腫脹，與模型組比較，有極顯著性差異（P<0.01）。這說明神蜂精對(duì)AA大鼠有抗炎作用。見表1。

表1 神蜂精對(duì)AA大鼠足爪腫脹度的影響（±s ）

表1 神蜂精對(duì)AA大鼠足爪腫脹度的影響（±s ）

注：與模型組相比，*P<0.05，**P<0.01。

組別致炎后足爪腫脹度（mm）給藥前（d15） 給藥第6d 給藥第12d 給藥第18d 給藥第24d模型組 5.342±0.514 5.198±0.716 4.878±0.683 4.828±0.645 4.754±0.652陽性組 5.180±0.440 3.233±0.222** 2.190±0.188** 2.140±0.141** 2.044±0.179** 高劑量組 5.196±0.105 3.954±0.122* 2.228±0.283** 2.204±0.258** 2.020±0.140** 中劑量組 5.110±0.277 4.015±0.461 2.435±0.224** 2.280±0.224** 2.103±0.194** 低劑量組 5.130±0.152 4.062±0.134 2.514±0.248** 2.394±0.176** 2.250±0.110**

3.3 神蜂精對(duì)AA大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

神蜂精對(duì)AA大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組胸腺指數(shù)顯著減?。≒<0.01），脾臟指數(shù)顯著增加（P<0.01）。與模型組比較，神蜂精治療各組和陽性藥物組胸腺指數(shù)顯著提高（P<0.05），脾臟指數(shù)顯著降低（P<0.05）。神蜂精高、中、低劑量組與陽性對(duì)照組各組之間無顯著性差異（P>0.05）。說明神蜂精和陽性對(duì)照組均能改善胸腺萎縮和脾臟增大，對(duì)胸腺、脾臟免疫器官有保護(hù)作用，可以提高機(jī)體免疫力。神蜂精組在改善胸腺萎縮方面有優(yōu)于陽性藥物組的趨勢。見圖1。

3.4 神蜂精對(duì)AA大鼠血清中TNF-α，IL-1β含量的影響

神蜂精對(duì)AA大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量影響的實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組血清中TNF-α、IL-1β含量極顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，神蜂精治療組血清中TNF-α、IL-1β含量極顯著降低（P<0.01）。而神蜂精各組與陽性組相比無顯著性差異（P>0.05）。說明神蜂精和陽性藥物治療均能抑制AA大鼠致炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的增加，從而緩解其炎癥反應(yīng)。見表2。

圖1 神蜂精對(duì)AA大鼠胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的影響

3.5 神蜂精對(duì)AA大鼠血清中IL-4、IL-10含量的影響

神蜂精對(duì)AA大鼠血清中IL-4、IL-10含量影響的實(shí)驗(yàn)和統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示：與正常組相比，模型組血清中IL-4、IL-10含量極顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，神蜂精高劑量組血清中IL-4、IL-10含量極顯著增加（P<0.01），其余組血清中IL-4、IL-10含量與模型組相比無顯著性差異（P>0.05）。說明神蜂精能促進(jìn)AA大鼠抗炎性細(xì)胞因子IL-4、IL-10的增加，而且高劑量組效果較好。見表3。

表2 神蜂精對(duì)AA大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量的影響（±s ）

表2 神蜂精對(duì)AA大鼠血清中TNF-α、IL-1β含量的影響（±s ）

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

組別 N TNF-α（ng/ml） IL-1β（pg/ml）正常組 10 8.2880±0.4740△△ 220.9543±15.6662△△ 模型組 10 15.6848±1.6889** 416.4953±17.0825** 陽性對(duì)照組 10 9.9710±0.5492△△ 286.6850±17.0842△△ 神蜂精高劑量組 10 9.4140±0.5913△△ 291.1862±20.4698△△ 神蜂精中劑量組 10 9.9490±1.0686△△ 297.2420±27.8346△△ 神蜂精低劑量組 10 10.1950±0.8051△△ 305.6137±28.8670△△

表3 神蜂精對(duì)AA大鼠血清中IL-4，IL-10含量的影響（±s ）

表3 神蜂精對(duì)AA大鼠血清中IL-4，IL-10含量的影響（±s ）

注：與正常組相比，*P<0.05，**P<0.01；與模型組相比，△P<0.05，△△P<0.01。

組別 N IL-4（pg/mL） IL-10（pg/mL）正常組 10 67.4833±6.6830△△ 51.2654±2.2045△△ 模型組 10 48.2447±3.7790** 42.0322±2.5574** 陽性對(duì)照組 10 59.1074±3.6100 45.5640±3.1865神蜂精高劑量組 10 61.2716±3.4952△△ 50.6528±2.1338△△ 神蜂精中劑量組 10 59.2352±1.8295 47.5770±2.5642神蜂精低劑量組 10 58.4930±0.8629 44.2553±4.7036

4 討論

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的動(dòng)物模型較多，但經(jīng)典的大鼠模型是佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠模型[9]。該模型的組織病理學(xué)和免疫學(xué)改變與人RA相似，而且模型的制備操作簡便易行，造模周期較短，重復(fù)性好，可同時(shí)獲得大量模型動(dòng)物，因此作為RA的基礎(chǔ)研究十分適宜[10]。因此本文選用了佐劑性關(guān)節(jié)炎模型。

大鼠足爪腫脹度是反映AA大鼠炎癥程度的主要指標(biāo)[11，12]，可以評(píng)價(jià)神蜂精對(duì)AA大鼠是否具有抗炎作用。在本研究造模期間，AA大鼠的足爪腫脹出現(xiàn)了兩次高峰，與文獻(xiàn)[13，14]所報(bào)道的AA大鼠經(jīng)歷的幾個(gè)階段性變化基本相似，即CFA注射24 h后，注射足的足爪急性腫脹，第3d急性腫脹達(dá)到最大值，之后急性炎癥緩解，第12～14 d足爪炎癥出現(xiàn)第二次高峰期。本研究結(jié)果還表明，模型組大鼠足爪腫脹度明顯高于正常對(duì)照組，表明AA大鼠模型復(fù)制成功。AA大鼠的足爪腫脹度結(jié)果顯示，給藥初期，高劑量神蜂精和陽性藥物的治療效果更為明顯。但是隨著給藥周期變長，神蜂精各組和陽性組消腫效果無顯著差異性。根據(jù)以上研究結(jié)果表明神蜂精具有抗炎作用。

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種自身免疫性疾病。胸腺和脾臟作為機(jī)體的免疫器官，可能參與到類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病過程[15]。其中胸腺為機(jī)體重要的中樞免疫器官，是T細(xì)胞分化的重要場所。脾臟具有造血、貯血和過濾作用，也是T細(xì)胞和B細(xì)胞發(fā)生免疫反應(yīng)的重要場所。因此，胸腺、脾臟指數(shù)能在一定程度上反映免疫調(diào)節(jié)作用。有文獻(xiàn)顯示，在AA大鼠模型建立時(shí)，胸腺、脾臟指數(shù)會(huì)發(fā)生一定變化[16，17]。本文研究結(jié)果顯示AA大鼠胸腺萎縮，脾臟增大。神蜂精治療后AA大鼠胸腺和脾臟病變減輕。這表明神蜂精可能對(duì)胸腺和脾臟免疫器官起到保護(hù)作用，提高機(jī)體抗炎免疫能力。但是具體機(jī)制仍有待于進(jìn)一步研究。

細(xì)胞因子作為免疫調(diào)節(jié)介質(zhì)在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)生過程中起著重要作用。在RA發(fā)病過程中，細(xì)胞因子平衡失調(diào)。RA中的滑膜細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞處于高度活化狀態(tài)，可合成TNF-α，IL-1β等多種致炎性細(xì)胞因子[18]。同時(shí)機(jī)體也產(chǎn)生IL-4，IL-10等抗炎性因子，相應(yīng)地起到促使炎癥修復(fù)的作用[18]。TNF-α是單核或巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，能夠趨化吸引炎癥細(xì)胞進(jìn)入滑膜和關(guān)節(jié)腔內(nèi)，導(dǎo)致骨和軟骨的破壞等，是關(guān)節(jié)炎發(fā)病的重要炎癥介質(zhì)。IL-1β是炎癥、組織損傷及免疫反應(yīng)的主要介質(zhì)之一，可刺激T細(xì)胞活化，刺激膠原酶合成，使破骨細(xì)胞產(chǎn)生增加，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，軟骨降解。本研究顯示AA大鼠體內(nèi)TNF-α和IL-1β含量增加，神蜂精治療后TNF-α和IL-1β含量會(huì)降低，關(guān)節(jié)炎癥緩解。IL-4和IL-10作為抗炎癥性物質(zhì)，對(duì)炎癥因子（如IL-1β、TNF-α）的釋放有抑制作用。本研究顯示神蜂精治療后AA大鼠體內(nèi)IL-4和IL-10含量會(huì)增加。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示神蜂精對(duì)AA大鼠具有治療作用，其可能機(jī)制是：保護(hù)胸腺和脾臟免疫器官，提高機(jī)體抗炎免疫能力；抑制致炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的生成，促進(jìn)抗炎性細(xì)胞因子IL-4和IL-10的產(chǎn)生。

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