牛乳鐵蛋白肽LfcinB（4-9）抗中蜂囊狀幼蟲病的作用效果研究

曹 蘭 戴榮國 王瑞生 任 勤 程 尚 沈克飛 姬聰慧 羅文華

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460）

中蜂囊狀幼蟲病是對中蜂養(yǎng)殖危害極其嚴(yán)重的病毒性疾病，傳染性極強(qiáng)。該病病原為中華蜜蜂囊狀幼蟲病病毒，是單股正鏈小RNA樣病毒。該病主要采取綜合防治措施防控，如：換王斷子、嚴(yán)格消毒、加強(qiáng)管理，使用抗病毒藥物配以抗生素預(yù)防繼發(fā)感染。目前，該病由于缺乏安全高效的抗病毒藥物，生產(chǎn)中存在濫用藥物現(xiàn)象，這使我國當(dāng)前蜂產(chǎn)品藥物殘留較高，蜂產(chǎn)品出口受限。因而，研發(fā)高效、安全、無殘留的蜂藥是當(dāng)今養(yǎng)蜂業(yè)的迫切需求。

牛乳鐵蛋白肽是由牛乳鐵蛋白經(jīng)蛋白酶消化后釋放的一系列多功能天然活性肽，其中LfcinB具有廣泛的生物學(xué)活性，具有廣譜殺菌、抗病毒、消炎、抑制腫瘤細(xì)胞生長及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)等作用。據(jù)研究[1]，LfcinB可以抑制HIV、細(xì)胞巨化病毒、皰疹1型病毒、肝炎病毒和流感病毒等。McCann（2003）研究揭示蛋白肽可能通過作用于易感細(xì)胞表面干擾病毒與細(xì)胞表面受體的相互作用，阻止病毒吸附和進(jìn)入細(xì)胞，如LfcinB和人乳鐵蛋白肽LfcinH的抗皰疹病毒感染就是通過直接與宿主細(xì)胞表面的硫化肝素或粘多糖結(jié)合，阻止HSV病毒與細(xì)胞表面HS和粘多糖結(jié)合，達(dá)到抑制HSV感染的目的。本試驗主要是觀察LfcinB（4-9）抗中蜂囊狀幼蟲病的作用效果。

1 材料與方法

1.1 蜂群

要求蜂群健康無病，各蜂群的群勢基本一致，平均為4足框，配置基本飼養(yǎng)蜂具。

1.2 LfcinB（4-9）

由L型氨基酸組成，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成制備，高效液相色譜純度大于99%。

1.3 中蜂囊狀幼蟲病病毒

采集具有典型中蜂囊狀幼蟲病癥狀的染病病蟲，用RT-PCR檢測中蜂囊狀幼蟲病病毒顯陽性[2]。

1.4 幼蟲死亡率檢測耗材

30×50cm透明薄膜、記號筆、照相機(jī)等。

試驗分成5組，每個試驗組3群蜂，共計15群。

1.5 病毒制備

將1 g感染中蜂囊狀幼蟲病的蜂幼蟲放在研磨器中研磨10 min，混懸液經(jīng)12 000 r/m離心10 min，吸取上清。上清經(jīng)0.22μm微孔濾膜過濾，加入1000 ml糖水中，即為病毒種子液。

1.6 病毒接種

將病毒種子液在傍晚時分噴灑于試驗蜂群中，每脾雙面噴，最后噴巢門，連續(xù)噴灑病毒液3天，待檢查發(fā)病后用于實驗。

1.7 分組與給藥

將蜂群分為5組，見表1。以上試驗組傍晚飼喂糖漿（白砂糖：水=1：1.2），每次每足脾飼喂50 ml糖漿，隔日飼喂一次，連續(xù)9天。每9天測定幼蟲死亡率。

表1 試驗分組

1.8 幼蟲死亡率測定方法

開箱后先將子脾蜜蜂抖落在蜂箱中，用蜂掃掃掉殘留在脾上的蜂，然后將脾平放在瓷盤中，用30×50cm的薄膜貼在脾上做好定位標(biāo)記，在薄膜上標(biāo)記未封蓋的100只幼蟲或卵巢房，計數(shù)為標(biāo)記幼蟲或卵A只。9天后用標(biāo)記的薄膜貼在原來的仔脾上，對準(zhǔn)位置，查看紅色標(biāo)記的巢房是否封蓋，若未封蓋，在薄膜上標(biāo)記并計算未封蓋或者穿孔的封蓋子數(shù)，計數(shù)為未封蓋幼蟲或卵B只。未封蓋的幼蟲或穿孔封蓋子一旦發(fā)病，必將死亡即假定認(rèn)為該幼蟲發(fā)病死亡，該群幼蟲的發(fā)病率即為該群的幼蟲死亡率。同時，做好下一次的幼蟲或卵標(biāo)記，重復(fù)上述試驗。

幼蟲死亡率=B/A×100%[3]

1.9 病情指數(shù)計算方法[3]

按幼蟲發(fā)病死亡輕重程度分級。0級：子脾上未發(fā)現(xiàn)病蟲；1級：病死蟲數(shù)占總幼蟲數(shù)小于5%；2級：病死蟲數(shù)占總幼蟲數(shù)的5%～30%；3級：病死蟲數(shù)占總幼蟲數(shù)大于30%。病情指數(shù)越大，說明病害越嚴(yán)重。

1.1 0 防治效果[3]

利用各處理組蜂群的幼蟲死亡率，計算LfcinB（4-9）對蜂群的防治效果。

2 結(jié)果

2.1 LfcinB（4-9）對中蜂囊狀幼蟲病幼蟲死亡率的影響

試驗蜂群攻毒后，測定蜂群用肽前、用肽后第9天和第18天的幼蟲死亡率，見表2。給藥后第9天和第18天，相對于攻毒未給藥的第4組，第1、第2、第3給藥組幼蟲死亡率明顯降低。給藥后第9天，第2組和第3組較第4組差異顯著，幼蟲死亡率分別降到18.67%和19.00%，第四組幼蟲死亡率升高為46.50%；給藥后第18天，第1組和第2組較第4組差異顯著，幼蟲死亡率分別為23.46%和19.63%，第3組與第4組差異極顯著，幼蟲死亡率為17.08%，第4組幼蟲死亡率37.25%。

表2 牛乳鐵蛋白肽對中蜂囊狀幼蟲病幼蟲死亡率的影響

2.2 LfcinB（4-9）對蜂群病情指數(shù)的影響

試驗開始前后跟蹤測定每群幼蟲死亡率多次，即給肽前（第一次、第二次）、給肽后（第三次、第四次）和停肽后（第五次、第六次）。飼喂LfcinB（4-9）17天以后，中蜂囊狀幼蟲病幼蟲死亡率的病情指數(shù)呈下降趨勢，第3組的病情指數(shù)較其它兩組的低。三組病情指數(shù)均在66.7%以上，低于發(fā)病沒用肽的第4組，高于沒發(fā)病沒用肽的第5組。

圖1 LfcinB（4-9）對試驗蜂群病情指數(shù)情況圖

2.3 LfcinB（4-9）對中蜂囊狀幼蟲病的防治效果

LfcinB（4-9）對中蜂囊狀幼蟲病在短期（9天）內(nèi)防治作用不明顯，最高防治效果為第2組59.85%，最低防治效果為第一組50.54%，第三組為59.14%。長時間（18天后），LfcinB（4-9）對中蜂囊狀幼蟲病防治作用較突出，其中第三組的防治效果最好為72.02%，最低為第一組40.32%，第二組為55.14%。此結(jié)果表明低濃度（第三組）的LfcinB（4-9）對中蜂囊狀幼蟲病的防治效果較好。

3 討論

由本次試驗可以看出，飼喂LfcinB（4-9）后，受試蜂群病情有所好轉(zhuǎn)，低濃度2.83mg/1000ml的Lf cin B（4-9）的糖漿治療效果較高濃度的LfcinB（4-9）較好。至于2.83mg/1000ml的LfcinB（4-9）糖漿是不是最佳防治該病的濃度，還需進(jìn)一步研究。另外，在短時間（9天左右）情況下LfcinB（4-9）對中蜂囊狀幼蟲的防治效果不明顯，最高為59.85%，長時間內(nèi)（18天左右），LfcinB（4-9）對中蜂囊狀幼蟲病的防治效果最高為72.02%，對蜂群病毒病來說有輕微治療效果。在第二年繁蜂季節(jié)，筆者發(fā)現(xiàn)凡飼喂了LfcinB（4-9）的蜂群均未發(fā)幼蟲病，而未飼喂LfcinB（4-9）的陽性對照組仍可見嚴(yán)重的中蜂囊狀幼蟲病。筆者認(rèn)為蜂群感染病毒發(fā)病后，在幼蟲期任何一種藥物可能都無法挽回感染蜂群單個個體的幼蟲生命，因為正常的幼蟲歷經(jīng)5天后即成封蓋子蜂蛹，處于幼蟲期的5天時間，要想使用藥物阻斷病毒繁殖感染其它幼蟲或者殺滅幼蟲體內(nèi)病毒，是非常困難的。本試驗對發(fā)病蜂群施肽的目的在于防止新孵出的健康幼蟲被帶毒病死蟲感染，所以使用LfcinB（4-9）防治中蜂囊狀幼蟲病需要過程和時間，其效果更多在于蜂群施肽后期的抗病力表現(xiàn)。

表3 LfcinB（4-9）對中蜂囊狀幼蟲病的防治效果

對于LfcinB（4-9）對中蜂囊狀幼蟲病的防治作用，筆者設(shè)想其作用機(jī)理。在發(fā)病蜂群內(nèi)，病死幼蟲感染新孵出的健康幼蟲，主要傳播者是成年蜂，因為成年蜂體內(nèi)也帶毒，使用牛乳鐵蛋白肽飼喂蜂群，首先是成年蜂消化道接觸牛乳鐵蛋白肽，筆者設(shè)想該肽可以修復(fù)或潤滑通暢成年蜂體內(nèi)消化道，使其病毒不易在體內(nèi)生存，從而減少新孵出幼蟲的感染機(jī)會。

[1]陳歷俊，姜鐵民.乳鐵蛋白生物功能及基因表達(dá)[M].北京：科學(xué)出版社，2007.

[2]曹蘭，張邑帆，戴榮國，等.用RT-PCR方法鑒定中蜂囊狀幼蟲病病毒.中國蜂業(yè)，2011，62（7-9）：33-35.

[3]王建鼎，梁勤，蘇榮.蜜蜂保護(hù)學(xué)[M].中國農(nóng)業(yè)出版社，1997.