忽地笑加蘭他敏生物合成代謝途徑中COMT酶基因克隆及序列分析

桂柳姿，崔培梧，潘清平，唐金鳳，魯耀邦

（1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙410208；2.湖南省中藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，湖南 長沙410208；3.廣東醫(yī)學院，廣東；4.中藥藥性與藥效三級科研實驗室，湖南 長沙410208）

忽地笑（Lycoris aurea），又名黃花石蒜，是石蒜科（Amaryllidaceae）石蒜屬(Lycoris Herb.)多年生草本植物，其在生長繁殖過程中會產生多種生物堿，其中加蘭他敏（Galanthamine）是一種芐基乙胺類生物堿[1]，屬乙酰膽堿酯酶抑制劑[2]，為治療阿爾茨海默氏病（Alzheimer’s Disease，AD）的首選藥物之一。由于化學合成加蘭他敏成本高昂，目前藥用加蘭他敏主要從石蒜科植物的鱗莖中提取分離得到[3]。在本課題組的前期研究中，比較了黃花石蒜花蕊和花葶組織中總RNA 的提取方法[4]，以及使用以RNA 差異顯示法篩選黃花石蒜中加蘭他敏合成相關基因[5]。

目前認為加蘭他敏在植物體內的生物合成途徑主要分為六個步驟，首先是原兒茶醛與酪胺（tyramine）合成降孤挺花啶(norbelladine)，然后降孤挺花啶在兒茶酚氧位甲基轉移酶 (catechol-O-methytransferase，COMT)的催化下接受一個甲基基團轉變?yōu)?-氧-甲基降孤挺花啶，而4-氧-甲基降孤挺花啶是加蘭他敏、文殊蘭胺（crinine）、石蒜堿（lycorine）等石蒜科生物堿的共同前體[3]。COMT 是一種S-腺苷-L-甲硫胺酸（SAM）依賴的甲基轉移酶，目前在煙草（Nicotiana tabacum）[6]、罌粟（Papaver somniferum）、唐松草（Thalictrum tuberosum）[7]和玉米（Zea mays）[8]等多種植物中被克隆。而本實驗首次從忽地笑克隆COMT 酶基因并對其編碼的蛋白質進行了生物信息學分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗材料 忽地笑花瓣于2012年7月10日采自湖南衡山，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學中藥鑒定學教研室潘清平教授鑒定后于-80 ℃保存。

1.1.2 主要試劑 RNAprep pure 植物總RNA 提取試劑盒(TIANGEN，北京)，SuperScriptTMIII Firststrand Synthesis System （Invitrogen，美國）、3’Full RACE Core set Ver.2.0、5’ Full RACE kit、pMD19-T Vector、Primer STARRHS DNA Polymerase、LA Taq、A-Tailing 試劑盒、Eoli.DH5α 感受態(tài)細胞(大連寶生物公司)，QIAquick Gel Extraction Kit （QIAGEN，德國），BIOWEST AGAROSE（Genetech，美國），100 bp DNA ladder Marker（北京鼎國生物技術有限公司）。

1.1.3 儀器 5332 PCR 儀、Biophotometer 6131 核酸蛋白分析儀（Eppendorf，德國），HE-120 Gen 多功能水平電泳槽、Tanon Eps300 型恒壓恒流電泳儀、GZS-1000B 凝膠圖像處理系統(tǒng) (上海天能科技有限公司)，恒溫震蕩培養(yǎng)箱（太倉市華美生化儀器廠），潔凈工作臺（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠），MV-100 微型真空離心濃縮儀 (日本TOMY 公司)，TGL-18M 型臺式高速冷凍離心機（湖南賽特湘儀高速離心機有限公司），超純水系統(tǒng)（北京帕思特科技有限公司），THA-3560C 高壓滅菌鍋（造鑫企業(yè)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 忽地笑花瓣總RNA 提取 從-80 ℃取出忽地笑花瓣，用植物總RNA 提取試劑盒提取其總RNA，具體操作按照說明書進行。提取后，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的完整性，并用核酸蛋白儀檢測其濃度，剩余量存于-80 ℃中。

1.2.2 忽地笑花瓣cDNA 第一鏈的合成 以總RNA 為模板，參照逆轉錄試劑盒說明書合成cDNA第一鏈，合成后存于-20 ℃。

1.2.3 忽地笑COMT 基因部分序列的克隆 參照NCBI 中已發(fā)表的高等植物的COMT 氨基酸序列同源區(qū)，利用Primer Premier5 軟件設計1 對簡并引物LaCOMT-R 和LaCOMT-F（表1）進行PCR 擴增。PCR 擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，53 ℃1 min，72 ℃1 min，35 個循環(huán)數(shù)；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收片段，連接轉化，藍白篩選，再取白色菌落送交至長沙博尚公司測序。

1.2.4 3’RACE 和5’RACE 擴增根據(jù)已獲得的COMT 基因的部分序列，利用Primer Premier5 軟件及Oligo 6.0 軟件設計3’RACE 和5’RACE 的特異性引物3R1、3R2、5R1 和5R2（表1），其分別與試劑盒提供的3’RACE Out Primer、3’RACE Inner Primer、5’ RACE Out Primer 和 5’RACE Inner Primer 進行PCR 擴增（表1）。3’ RACE Out PCR 擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃30 s，53 ℃30 s，72 ℃1 min，35 個循環(huán)數(shù)；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。3’RACE Inner PCR 擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃30 s，53 ℃50 s，72 ℃1 min，30個循環(huán)數(shù)；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。5’RACE Out PCR 擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃30 s，55 ℃50 s，72 ℃1 min，25 個循環(huán)數(shù)；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。5’RACE Outer PCR 擴增條件：98 ℃預變性3 min；98 ℃10 s，55.2 ℃15 s，72 ℃90 s，20 個循環(huán)數(shù)；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。5’RACE Inner PCR 擴增條件：94 ℃預變性3 min；94 ℃30 s，57 ℃30 s，72 ℃90 s，30 個循環(huán)數(shù)；72 ℃后延伸10 min；4 ℃保存。擴增產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收片段，連接轉化，藍白篩選，再取白色菌落送交至上海生工測序。

1.2.5 忽地笑COMT 基因全長的獲得 使用序列拼接軟件ContigExpress 對測序獲得的3’RACE 與5’RACE 片段進行拼接，得到COMT 基因的全長序列。

表1 忽地笑COMT 基因PCR 擴增引物

1.2.6 忽地笑COMT 基因序列的生物信息學分析

（1） 核苷酸性質分析 使用NCBI 提供的在線ORF Finder 尋找基因的編碼框；并使用BLAST搜索克隆的LaCOMT 氨基酸序列的同源序列，分析其的同源性。

（2） 蛋白質分析 用ProtParam 軟件（http://www.expasy.ch/tools/protparam.html）在線分析La-COMT 基因編碼蛋白質的分子量，等電點和不穩(wěn)定系數(shù)等；用ProtScale 軟件（http://www.expasy.ch/tools/protscale.html）在線分析蛋白質的親/疏水性；用SignalP 軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）在線檢測蛋白質信號肽；用TMHMM 軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM） 在線檢測蛋白質跨膜結構；二級結構使用SOPMA 軟件（http://npsapbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/nps a_sopma.html） 在線分析；三級結構使用SWISSMODEL 軟件（http://swissmodel.expasy.org/）在線自動建模。

（3） 基于COMT 氨基酸序列的物種進化分析使用DNAMAN 軟件將NCBI 中不同物種的13 種與LaCOMT 氨基酸序列具有一定同源性的序列進行比對，并用Observed Divergency 的距離模式將其集合在一起繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結果與分析

2.1 目的基因的克隆

用簡并引物LaCOMT-R 和LaCOMT-F 對忽地笑cDNA 第一鏈進行PCR 擴增，得到1 段492 bp堿基序列（圖1A）。根據(jù)這條序列為3’ RACE 與5’RACE 的巢式PCR 設計特異性引物，最后得到La-COMT 基因的3’端片段約600 bp（圖1B）和5’端片段約850 bp （圖1C）。通過序列拼接軟件ContigExpress 對3’ 端片段與5’ 端片段進行拼接，得到La-COMT 基因的全長序列約1300 bp，再通過NCBI 網(wǎng)站上的ORF finder 在線軟件分析LaCOMT 基因的開放讀碼框，結果顯示LaCOMT 基因序列有12 bp 的polyA 結構和1101 bp 編碼的366 aa 的開放閱讀框。

2.2 兒茶酚氧位甲基轉移酶基因系統(tǒng)進化分析

圖1 LaCOMT 的PCR 擴增

在NCBI 網(wǎng)站上通過BLAST 比對出LaCOMT 基因編碼的氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其不僅與其他植物的氧位甲基轉移酶（COMT）具有一定的同源性，而且與其他植物的咖啡酸氧位甲基轉移酶（CAOMT）也具有較高的同源性。使用DNAMAN 軟件對其進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建，發(fā)現(xiàn)忽地笑COMT 與荷蘭鳶尾（Iris x hollandica）CAOMT 的同源性最高，與罌粟（Papaver somniferum）、唐 松 草（Thalictrum tuberosum）和煙草（Nicotiana tabacum）COMT 的同源性次之，而玉米（Zea mays）COMT 與蜀黍（Sorghum bicolor）、葦狀羊茅 （Festuca arundinacea） 和黑麥草（Lolium perenne）CAOMT 聚為一類 （圖2）。由于COMT 與CAOMT 均屬于依賴S-腺苷-L-甲硫胺酸（SAM） 的氧位甲基轉移酶，通過上述分析可推斷COMT 與CAOMT 在進化過程中具有一定的保守性，其進化來源也可能具有一定的同源性。

2.3 LaCOMT 編碼蛋白序列與其他植物COMT 同源性比對分析

通過上述的系統(tǒng)發(fā)育進化分析后，再進一步分析LaCOMT 與其他植物COMT 同源性，發(fā)現(xiàn)其與忽地笑、唐松草、煙草和玉米的同源性高達74%，且具有依賴SAM 的甲基轉移酶蛋白的三個保守區(qū)：(V/I/L)VDVGGGXG、VPX (A/P/G)DAXXMKWI 和 AL PXXGKVIXXEXILP（圖3）。

圖2 基于忽地笑兒茶酚氧位甲基轉移酶基因的不同物種的基因進化樹

圖3 LaCOMT 氨基酸序列與其他植物兒茶酚氧位甲基轉移酶比對結果

2.4 忽地笑兒茶酚氧位甲基轉移酶蛋白特性分析

2.4.1 LaCOMT 蛋 白 理 化 性 質 分 析 根 據(jù)Prot-Param 在線軟件預測表明，LaCOMT 蛋白分子式為C1824H2861N467O527S23，分子量為40501.9；等電點pI 為5.95；帶負電荷氨基酸殘基(Asp+Glu)為42，帶正電荷氨基酸殘基(Arg+Lys)為36；穩(wěn)定系數(shù)為38.13，該值在40 以下，說明LaCOMT 蛋白單體是穩(wěn)定的；脂肪系數(shù)為90.63；總平均親水性為-0.037，同時結合ProtScale 在線軟件預測LaCOMT 蛋白的親/疏水性氨基酸分布圖（圖4）表明，親水性氨基酸和疏水性氨基酸較均勻的分布于整個氨基酸序列中，故此蛋白單體沒有明顯的疏水性；估計體外半衰期為30h。含量較高的氨基酸依次為Leu （9.6% ）、Ala（7.9%）、Lys （7.7%）、Ile （7.4%）、Gly （7.1%）、Ser（6.8%）、Asp（5.7%）、Glu（5.7%）、Val（5.7%）和Pro（5.5%）。

圖4 LaCOMT 蛋白疏水性分析圖

2.4.2 LaCOMT 蛋白氨基酸序列信號肽及跨膜結構域的預測和分析 用SignalP 在線軟件對LaCOMT蛋白的N 端的前70 bp 氨基酸片段進行的信號肽檢測表明，其C 值、S 值和Y 值的計算結果均為NO，且平均值少于0.5，預測出此蛋白無信號肽（圖5），推斷LaCOMT 蛋白為非分泌蛋白。用TMHMM在線軟件分析蛋白的跨膜結構域，預測出此蛋白無跨膜區(qū)，推斷LaCOMT 酶發(fā)揮功能的部位不結合于生物膜上。

圖5 LaCOMT 蛋白信號肽分析圖

2.4.3 LaCOMT 蛋白二級結構預測 使用SOPMA在線軟件預測LaCOMT 蛋白二級結構，結果表明，有168 個氨基酸可形成α 螺旋，54 個氨基酸可形成延伸帶，23 個氨基酸可用于形成β 轉角，其余121 個氨基酸可形成無規(guī)卷曲。

2.4.4 LaCOMT 蛋白三級結構預測 使用SWISSMODEL 預測LaCOMT 蛋白三級結構，采用自動模式建模，預測出LaCOMT 基因編碼的蛋白對應1kyzE 模型（圖6A）的E 值為4.05e-141，序列的一致性為67.61%，1kyzE 是植物中咖啡酸氧位甲基轉移酶的模板，LaCOMT 亦具有甲基轉移酶的功能，說明以1kyzE 模型為樣板預測的LaCOMT 單體三級結構圖是可靠的（圖6B）。

圖6 忽地笑兒茶酚氧位甲基轉移酶的三級結構預測圖

3 討論

本實驗獲得忽地笑兒茶酚氧位甲基轉移酶（LaCOMT）基因序列后，通過分析其開放閱讀區(qū)編碼的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)其具有依賴S-腺苷甲硫胺酸（SAM）的甲基轉移酶蛋白的三個保守區(qū)[9]：(V/I/L)VDVGGGXG、VPX (A/P/G)DAXXMKWI 和AL PXXGKVIXXEXILP，SAM 的作用是在甲基轉移酶的作用下為底物提供甲基，故此保守序列可初步說明此次實驗所克隆得到的序列為COMT 基因序列。同時對COMT 進行同源性比對發(fā)現(xiàn)LaCOMT 與來源于煙草、唐松草、玉米和罌粟的COMT 的同源性高達74%，這進一步說明此次實驗所得的序列為COMT 序列。本實驗克隆的LaCOMT 基因讀碼框共1101bp，共編碼366 個氨基酸，與梁麗建等[10]研究的石蒜COMT（LrCOMT）基因編碼的氨基酸數(shù)目一致，但氨基酸序列有所不同。

LaCOMT 基因編碼的氨基酸序列的理化性質和二級結構分析結果表明該基因編碼的蛋白質穩(wěn)定，為非分泌性蛋白，其酶促作用的發(fā)生不結合生物膜。COMT 進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建以及LaCOMT 蛋白三級結構建模結果表明COMT 與咖啡酸氧位甲基轉移酶（CAOMT）具有較高的同源性，各自作用于不同底物，分別為兒茶酚胺類化合物和5-羥基松伯醇[11]，并且CAOMT 也是依賴SAM 的一種甲基轉移酶，可初步推斷COMT 與CAOMT 在進化可能具有同一祖先且COMT 在進化上具有相當?shù)谋Ｊ匦浴?/p>

Eichhom 等[12]以Leucojum Amaestivum 為 材 料通過放射性和重同位素標記生物合成的可能前體，研究加蘭他敏的生物合成途徑，推測出加蘭他敏的生物合成的可能途徑主要有五個步驟，首先確定了降孤挺花啶在兒茶酚氧位甲基轉移酶的作用下獲得一個甲基轉變?yōu)?-氧甲基降孤挺花啶，再按照以下路線進行轉化：4-氧甲基降孤挺花啶→N-去甲那維定→N-去甲加蘭他敏→加蘭他敏。加蘭他敏和那維定可以相互轉變。后來，Dewick[3]在其書中對加蘭他敏多生物合成途徑進行了補充，其認為降孤挺花啶由原兒茶醛與酪胺合成，但依舊沒能指出生物合成途徑中其他各步驟中需要的酶類。本研究對忽地笑COMT 基因進行了克隆及序列分析，為忽地笑加蘭他敏生物合成關鍵酶基因研究提供了實驗依據(jù)及研究思路。但忽地笑加蘭他敏生物合成途徑的其它酶促反應機制有待進一步研究。

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