加減射麻止喘湯對(duì)哮喘大鼠支氣管平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)周期的干預(yù)作用

王維益，劉建博，郭 敏，蔡俊翔，雷 源

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州501405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州501405）

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，哮喘是由多種細(xì)胞包括氣道的炎性細(xì)胞和結(jié)構(gòu)細(xì)胞（如嗜酸粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、氣道上皮細(xì)胞等）和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]，其原因是氣道發(fā)生了重構(gòu)[2]，其中支氣管平滑肌細(xì)胞（ASMC）增殖在氣道重構(gòu)中占有十分重要的地位。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)MTT法及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)分析加減射麻止喘湯對(duì)哮喘大鼠ASMC 增殖的干預(yù)作用，為支氣管哮喘的進(jìn)一步防治提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)SD 雄性大鼠，體質(zhì)量250～300 g，35 只，合格證號(hào)：0080764 0077574，許可證號(hào)：scxk(粵)2008-0020，廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2 加減射麻止喘液湯方藥 射干，地龍，椒目，北杏仁，法半夏，桔梗，細(xì)辛，甘草，質(zhì)量比為1∶1.2∶1∶0.6∶1.2∶1.2∶0.6∶0.6，按傳統(tǒng)煎藥法制成含生藥為1.48 g/mL 的水劑。

1.1.3 試劑 注射用青霉素鈉（批號(hào)：Y1203411）、注射用硫酸鏈霉素（批號(hào)：1009104）購(gòu)于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院；雞卵清蛋白（批號(hào)：9006-59-1）、氫氧化鋁(批號(hào)：21645-51-2)購(gòu)于廣州齊云生物技術(shù)有限公司；PMA(批號(hào)：1626450)購(gòu)于LClabs 公司；Ro-31-8220（批號(hào)：sc-200619）購(gòu)于Santa Cruz 公司；核糖核酸酶（RNA 酶）（批號(hào)：182651301）、四甲基偶氮唑鹽（MTT）（批號(hào)：132613903）購(gòu)于Sigma 公司；木瓜蛋白酶（批號(hào)：1626405）購(gòu)于Merck 公司；膠原酶I型（批號(hào)：17100-017）購(gòu)于Gibco 公司；DMEM 高糖培 養(yǎng) 液 （批號(hào)：GNM12800）、胰蛋白酶 (批號(hào)：SH30042.01)、PBS 緩沖液（批號(hào)：GNM200120）、胎牛血清(FBS)（批號(hào)：SV30087.01）購(gòu)于Hyclone 公司；碘化丙啶(PI)（批號(hào)：95458）、二甲基亞砜（DMSO）(批號(hào)：196055)、牛血清白蛋白（BSA）（批號(hào)：021624104）購(gòu)于廣州威佳科技有限公司。

1.1.4 主要儀器 402AI 超聲霧化器由江蘇魚(yú)躍醫(yī)療設(shè)備股份有限公司生產(chǎn)；Epics Altra 流式細(xì)胞儀由美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司生產(chǎn)；TDL-5 離心機(jī)由上海天本公司生產(chǎn)；LX70 倒置顯微鏡由日本Olympus公司生產(chǎn)；550 酶標(biāo)儀由美國(guó)BIO-RAD 公司生產(chǎn)；SL 型CO2培養(yǎng)箱由美國(guó)Sheldon 公司生產(chǎn)；自制霧化箱 （35 cm×23 cm×21 cm，箱壁上有一大小約12 cm2可放入霧化管的孔）。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將35 只大鼠分為空白組4 只，正常組5 只，模型組5 只，加減射麻止喘湯高、中、低劑量組各7 只。

1.2.2 哮喘大鼠模型建立[3]哮喘模型組大鼠5只，第1 天每只大鼠腹腔注射含10 mg 卵清蛋白和200 mg 氫氧化鋁的生理鹽水1.5 mL，第8 天重復(fù)致敏1 次，第15 天開(kāi)始激發(fā)，將大鼠置于自制霧化箱內(nèi)，用超聲霧化器噴入含20 mg/mL 卵清蛋白的生理鹽水，激發(fā)30 min，1 次/d，激發(fā)后大鼠出現(xiàn)煩躁、嗆咳、呼吸加快等哮喘發(fā)作癥狀，共激發(fā)15 d。正常組大鼠5 只，不予藥物致敏及霧化。

1.2.3 含藥血清制備 將21 只大鼠隨機(jī)分為高、中、低加減射麻止喘湯給藥劑量組（分別予含生藥14.8 g/kg、7.4 g/kg、1.48 g/kg 的加減射麻止喘湯），每天灌胃1 次，連續(xù)7 d。空白組大鼠4 只，不予藥物灌胃。7 d 后各組大鼠分別眼眶靜脈采血，離心血清 （3 000 r/min，37 ℃，20 min），56 ℃、30 min 滅活，-20 ℃冷藏備用。

1.2.4 哮喘模型組大鼠支氣管平滑肌的病理鏡檢及ASMC 的提取與傳代培養(yǎng) 哮喘模型組大鼠造模成功后最后一次激發(fā)后24 h 內(nèi)，脫頸處死大鼠并浸泡酒精后取出，分離出支氣管，提取少量支氣管同正常對(duì)照組大鼠支氣管行鏡檢（HE 染色），觀察病理特點(diǎn)提示哮喘大鼠造模成功（見(jiàn)圖1～2）。哮喘模型組大鼠其余支氣管置入PBS 液中，用眼科剪剔除肺組織、內(nèi)外膜及結(jié)締組織等，直至支氣管接近透明。將獲得的支氣管平滑肌組織盡量剪碎，置于含1 mg/mL 膠原酶I 型、1 mg/mL 木瓜蛋白酶、10 mg/mL BSA 的PBS液中，37 ℃消化約20 min 后，室溫800 r/min 離心5 min，棄上清液后高糖培養(yǎng)液（DMEM）洗滌2 次，細(xì)胞篩篩去組織，用含20% FBS、100 U/mL 青霉素鈉、100 U/mL 硫酸鏈霉素的DMEM 懸浮所分離的細(xì)胞，種植于25 cm2培養(yǎng)瓶，置于37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3 d 換液1 次，約14 d 細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)90%融合后傳代培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)用3～5 代細(xì)胞。

圖1 哮喘模型組大支氣管平滑肌病理形態(tài)光鏡圖（HE ×200）

圖2 正常組大鼠支氣管平滑肌病理形態(tài)光鏡圖（HE ×100）

1.2.5 MTT 法檢測(cè)ASMC增殖培養(yǎng)的ASMC 按1×105個(gè)/孔接種于96 孔板，用高糖DMEM 液培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞同步于G0期后，分別予加減射麻止喘湯高、中、低劑量含藥血清、空白組大鼠血清、蛋白激酶C 激活劑佛波醇-12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯PMA (10 nmol/L) 及蛋白激酶C 抑制劑馬來(lái)酰亞胺甲磺酸鹽Ro-31-8220(5 μmol/L)干預(yù)，各組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，同時(shí)換用含體積分?jǐn)?shù)10% FBS 的DMEM 繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后，每孔加5 mg/mL MTT 20 μL，4 h后去培養(yǎng)液，加DMSO 150 μL 搖勻，約10 min 后用酶標(biāo)儀于450 nm 處測(cè)定各孔吸光度D 值。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)ASMC 周期 傳代后的ASMC 按1×105個(gè)/mL 接種于6 孔板，細(xì)胞同步于G0期后分組，均予含10% FBS 的DMEM 液繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)每 1 mL 細(xì)胞培養(yǎng)液中分別予 PMA(10 nmol/L)、Ro-31-8220(5 μmol/L)、含藥血清(加減射麻止喘湯高劑量組)及空白組大鼠血清干預(yù)，24 h后0.25%胰蛋白酶消化收集細(xì)胞，PBS 配制濃度為1×105個(gè)/mL 細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的75%乙醇固定，-4 ℃冰箱內(nèi)放置24 h，800 r/min 離心5 min 沉淀細(xì)胞，棄上清液，PBS 洗滌1 次，先后加入50 μg/mL RNA 酶和10 μg/mL PI 各0.5 mL，室溫避光放置30 min，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s 表示，多組間比較采用F 檢驗(yàn),兩兩之間比較采用q 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 加減射麻止喘湯各組大鼠ASMC D 值

哮喘模型組大鼠ASMC 中，PMA 組D 值較正常組顯著增加（P＜0.05)，Ro-31-8220 組的D 值較正常組顯著降低（P＜0.05)，加減射麻止喘湯高、中、低劑量組的D 值較正常組、PMA 組顯著降低（P＜0.05)；中劑量組的D 值和Ro-31-8220 組無(wú)顯著差異（P＞0.05)，高低劑量組的D 值較Ro-31-8220 組顯著增加 （P＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 加減射麻止喘湯各組大鼠ASMC 各周期分布百分比

表1 加減射麻止喘湯對(duì)各組哮喘大鼠ASMC 的D 值的影響 （n=6，±s）

表1 加減射麻止喘湯對(duì)各組哮喘大鼠ASMC 的D 值的影響 （n=6，±s）

注：與正常組比較*P＜0.05；與PMA 組比較＃P＜0.05；與Ro-31-8220 組比較△P＞0.05，▲P＜0.05。

組 別 D 值PMA 組 0.952 2±0.045 8*▲Ro-31-8220 組 0.501 7±0.077 5*加減射麻止喘湯高劑量組 0.662 2±0.119 2*▲＃加減射麻止喘湯中劑量組 0.561 8±0.067 8*△＃加減射麻止喘湯低劑量組 0.686 8±0.201 0*▲＃正常組 0.810 5±0.054 8

哮喘模型組大鼠ASMC 中，PMA 組G1細(xì)胞百分比較正常組顯著降低，G2/M 期顯著增高（P＜0.05)，S 期無(wú)顯著差異（P＞0.05)；Ro-31-8220 組的G1期細(xì)胞百分比較正常組顯著升高，G2/M、S 期顯著降低（P＜0.05)；加減射麻止喘湯高劑量組的G1細(xì)胞百分比較空白組、PMA 組顯著升高，G2/M 期、S 期顯著降低（P＜0.05)；加減射麻止喘湯高劑量組的S 期與Ro-31-8220 組比較顯著升高（P＜0.05)，G2/M 期無(wú)顯著差異（P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表2 流式細(xì)胞法檢測(cè)各藥物干預(yù)組哮喘大鼠ASMC 各周期分布百分比 （±s，n=6，%）

表2 流式細(xì)胞法檢測(cè)各藥物干預(yù)組哮喘大鼠ASMC 各周期分布百分比 （±s，n=6，%）

注：與正常組比較*P＜0.05，▲P＞0.05；與PMA 組比較＃P＜0.05；與Ro-31-8220 組比較△P＜0.05，□P＞0.05。

組 別 G1 S G2/M PMA 組 55.183 3±3.757 3* 11.366 7±3.338 7▲ 33.483 3±2.658 1*Ro-31-8220 組 94.700 0±0.613 7* 2.500 0±0.687 1* 2.783 3±0.402 1*加減射麻止喘湯高劑量組91.950 0±1.091 3*＃ 5.800 0±2.101 4*△＃ 2.250 0±1.350 2*□＃正常組 62.950 0±1.348 7 12.483 3±3.754 2 26.433 3±6.077 1

3 討論

支氣管哮喘屬中醫(yī)學(xué)“哮病”、“喘證”范疇，其發(fā)病與肺、脾、腎三臟有關(guān)，多因痰飲內(nèi)伏、風(fēng)寒襲肺、痰濕壅阻、肺失宣降所致，故治療上多以化痰、平喘、宣肺、健脾、補(bǔ)腎等為主?！督饏T要略》記載“咳而上氣，喉中水雞聲，射干麻黃湯主之”，本研究中加減射麻止喘湯由射干麻黃湯加減化裁而成，具有宣肺平喘、祛痰止咳的功效。既往臨床與實(shí)驗(yàn)室研究提示射麻止喘液能明顯改善哮喘患者肺功能，其機(jī)制可能與拮抗炎性介質(zhì)、降低氣道高反應(yīng)性、降低血黏度［4］，降低血漿及肺組織ET 水平，抑制嗜酸性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)［5］，減少血漿cAMP 含量、增加cGMP 含量，松弛支氣管平滑?。?］等作用有關(guān)。

蛋白激酶C（PKC）是一類Ca2+、磷脂依賴性的蛋白激酶，在跨膜信號(hào)傳遞過(guò)程中起著重要作用，PKC 信號(hào)途徑是與細(xì)胞增殖有關(guān)的一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路［7-8］。已有研究表明［8］在PKC 激動(dòng)劑PMA 的刺激下，哮喘大鼠ASMC 細(xì)胞增殖水平明顯增高，而PKC 抑制劑Ro-31-8220 則能抑制細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)與PMA 組、Ro-31-8220 組、正常組哮喘大鼠ASMC 增殖情況比較，提示加減射麻止喘湯可影響哮喘大鼠平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，抑制細(xì)胞增殖，從而影響氣道重構(gòu)，而加減射麻止喘湯抑制哮喘大鼠支氣管平滑肌細(xì)胞增殖的作用與藥物濃度的關(guān)系有待進(jìn)一步研究與探討。

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