兩株紫色紅曲菌根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的T-DNA 轉(zhuǎn)化子的生物學(xué)特性＊

曹麗凌，齊育平，梁帥帥，施曉莉，蔣冬花

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

紅曲菌(Monascus spp.)又稱(chēng)為紅曲霉，是我國(guó)傳統(tǒng)的食用和藥用微生物，在我國(guó)己有上千年的應(yīng)用歷史［1］.近二十年來(lái)，紅曲菌的許多功效相繼被證實(shí)，它能分泌產(chǎn)生紅曲色素、莫吶可琳類(lèi)(Monacolins)物質(zhì)、γ-氨基丁酸、麥角固醇和豐富的水解酶類(lèi)等多種有益代謝產(chǎn)物［2-5］，是生產(chǎn)食品發(fā)酵劑、著色劑、保健食品、藥品或其他原料的重要微生物資源［6-9］.但是，自Blanc 等［10］研究發(fā)現(xiàn)某些紅曲菌株能產(chǎn)生對(duì)人體有害的真菌毒素——桔霉素(citrinin)以來(lái)，紅曲菌及其相關(guān)制品的安全性一直存在著爭(zhēng)議，從而影響到我國(guó)紅曲產(chǎn)品的出口.因此，如何調(diào)控紅曲菌的桔霉素代謝基因、降低桔霉素含量，是當(dāng)前紅曲菌研究的重要方向［11］.為了有效地控制紅曲中桔霉素的含量，提高紅曲色素等有益次生代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量，有必要從分子水平研究桔霉素與紅曲色素等其他代謝產(chǎn)物之間的相互關(guān)系.

本實(shí)驗(yàn)利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化紫色紅曲菌，篩選得到2 株產(chǎn)色素發(fā)生顯著變化的轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158，并對(duì)其菌落形態(tài)、生長(zhǎng)速度、顯微結(jié)構(gòu)、桔霉素含量及其遺傳穩(wěn)定性等進(jìn)行了分析，以期闡明紅曲色素代謝的分子機(jī)制，進(jìn)而為從分子水平上調(diào)控紅曲中的色素產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)，也為今后從紅曲菌中獲得產(chǎn)色素相關(guān)基因提供研究材料.

1 材料與方法

1.1 菌株

原始菌株:由本實(shí)驗(yàn)室篩選并保藏的一株高產(chǎn)紅曲色素的紫色紅曲菌(Monascus purpureus)菌株S.

轉(zhuǎn)化菌株:轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的紫色紅曲菌T-DNA 插入突變體庫(kù)，并由本實(shí)驗(yàn)室保藏.經(jīng)鑒定，轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 中均含潮霉素抗性標(biāo)記基因.

1.2 主要培養(yǎng)基

1)CYA 培養(yǎng)基 蔗糖30 g，NaNO33 g，酵母提取物5 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂18 g，蒸餾水加至1 L，pH 6.0.

2)MEA 培養(yǎng)基 麥芽浸出粉20 g，蛋白胨1 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，蒸餾水加至1 L，pH 6.0.

3)葡萄糖乙醇培養(yǎng)基 葡萄糖50 g，蛋白胨20 g，KH2PO48 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，乙 醇2 mL，瓊 脂20 g，蒸餾水加至1 L，pH 6.0.

4)搖瓶培養(yǎng)基 葡萄糖50 g，蛋白胨20 g，KH2PO48 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，乙醇2 mL，蒸餾水加至1 L，pH 6.0.

5)種子培養(yǎng)基 葡萄糖50 g，蛋白胨20 g，酵母提取物10 g，K2HPO410 g，MgSO4·7H2O 5 g，KCl 5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 1 g，蒸餾水1 L，pH 6.0.

6)固體培養(yǎng)基 將大米浸泡過(guò)夜，瀝干后稱(chēng)量30 g 分裝于250 mL 錐形瓶中.

以上培養(yǎng)基均在121 ℃滅菌20 min，培養(yǎng)基配方參照文獻(xiàn)［12-13］.

1.3 轉(zhuǎn)化子菌株遺傳穩(wěn)定性測(cè)定

用無(wú)菌牙簽將轉(zhuǎn)化子S62 和S158 菌絲挑取到不含潮霉素的葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)7 d.連續(xù)轉(zhuǎn)接6 次后，再轉(zhuǎn)接到含100 mg/mL 潮霉素的葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上，同時(shí)接種原始菌株S 作為對(duì)照，30 ℃培養(yǎng)，觀察突變子的生長(zhǎng)情況和菌落形態(tài)，測(cè)定其穩(wěn)定性.

1.4 轉(zhuǎn)化子菌株菌落生長(zhǎng)速度測(cè)定

將轉(zhuǎn)化子菌株接種于MEA，CYA 和葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，同時(shí)接種原始菌株S 作為對(duì)照，72 h 后每隔12 h 測(cè)量一次菌落直徑，直至菌落鋪滿整個(gè)平皿.

1.5 轉(zhuǎn)化子菌株形態(tài)觀察

將原始菌株S、轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 轉(zhuǎn)接到MEA，CYA 和葡萄糖乙醇培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)7～14 d，觀察菌落形態(tài)、大小、顏色，在顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子和閉囊殼等顯微形態(tài)特征.

1.6 轉(zhuǎn)化子菌株發(fā)酵色價(jià)檢測(cè)

1.6.1 液態(tài)發(fā)酵

將轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 及原始菌株S 接種于試管斜面上，30 ℃恒溫培養(yǎng)7 d 至菌絲長(zhǎng)滿斜面.用5 mL 無(wú)菌水洗下孢子，按2%的接種量接入裝有40 mL 搖瓶培養(yǎng)基的250 mL 錐形瓶中在30 ℃，200 r/min 振蕩培養(yǎng)7 d.按照Kim 等［14］的方法，取發(fā)酵液按1 ∶1 的體積比加入70%乙醇液，60 ℃水浴2 h，10 000 r/min 離心10 min，取上清.以相同處理(加70%乙醇液)的不接入紅曲菌的培養(yǎng)液作為空白對(duì)照.測(cè)定300～600 nm 波長(zhǎng)下的吸光度，分析吸收峰值.通常以在505 nm處測(cè)得的A 值乘以稀釋倍數(shù)的值作為色價(jià)［12］.

1.6.2 固體發(fā)酵

將5 mL 孢子懸浮液接入裝有50 mL 種子培養(yǎng)液的250 mL 三角瓶中，30 ℃，200 r/min 搖床上培養(yǎng)72 h，取發(fā)酵液備用.

將大米浸泡過(guò)夜，瀝干，稱(chēng)量30 g 分裝于250 mL錐形瓶中，121 ℃滅菌20 min，待其冷卻后每瓶加入3 mL 紅曲發(fā)酵種子液，30 ℃培養(yǎng)10 d，烘干，得紅曲米成品［15］.

1.7 轉(zhuǎn)化子菌株發(fā)酵產(chǎn)物中桔霉素含量分析

參照Pastrna 等［17］的方法檢測(cè)發(fā)酵后菌株中的桔霉素含量.取紅曲菌發(fā)酵液或紅曲米成品，加入10 mL 甲醇，制成樣品溶液.取2 μL 樣品溶液，同時(shí)取2 μL 10 mg/mL 桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為參照，點(diǎn)樣于硅膠板上，展開(kāi)劑為V(甲苯)∶V(乙酸乙酯)∶V(甲酸)=6 ∶3 ∶1，展開(kāi)，在紫外燈下顯影，拍照.

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)

作為研究基因功能的材料，要求其在遺傳上具有穩(wěn)定性.本實(shí)驗(yàn)將轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 接種到葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上，對(duì)突變子菌株進(jìn)行穩(wěn)定性檢測(cè).結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 均能在含有100 mg/mL 潮霉素的葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)，而原始菌株S 無(wú)法正常生長(zhǎng).這表明潮霉素抗性基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)化子紅曲菌基因組中，并能穩(wěn)定遺傳.

2.2 菌落生長(zhǎng)速度測(cè)定

將轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 接種于MEA，CYA 和葡萄糖乙醇培養(yǎng)基平皿上，30 ℃培養(yǎng)，同時(shí)接種原始菌株S 作為對(duì)照，接種72 h 后，每隔12 h 測(cè)量一次菌落直徑.結(jié)果(見(jiàn)圖1)顯示:在MEA 和葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 開(kāi)始時(shí)生長(zhǎng)速度都比原始菌株S 緩慢;在CYA 培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化子菌株S158 生長(zhǎng)速度比原始菌株S 快.在葡萄糖乙醇培養(yǎng)基中，與原始菌株S 相比，轉(zhuǎn)化子菌株S62 雖然一開(kāi)始菌落直徑比原始菌株S 小，但在培養(yǎng)108 h 后，其菌落直徑已與原始菌株S 相同，后來(lái)的生長(zhǎng)速度甚至超過(guò)了原始菌株S.

2.3 菌落及顯微形態(tài)觀察

2.3.1 菌落形態(tài)

將轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 接種到MEA，CYA 和葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上，30 ℃培養(yǎng)，在7 和14 d 時(shí)觀察比較轉(zhuǎn)化子菌株與原始菌株在菌落形態(tài)、顏色等方面的差異.結(jié)果表明，2 株轉(zhuǎn)化子菌株在菌落顏色、形態(tài)及菌落生長(zhǎng)速度上發(fā)生了較大的變化(見(jiàn)表1 和圖2).

圖1 MEA，CYA 和葡萄糖乙醇培養(yǎng)基上菌株的生長(zhǎng)速度

表1 轉(zhuǎn)化子S62 和S158 的菌落形態(tài)

圖2 轉(zhuǎn)化子S62 和S158 在不同培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)

2.3.2 顯微形態(tài)

顯微鏡下觀察菌株的形態(tài)特征，結(jié)果如圖3所示:原始菌株S 的菌絲粗壯，且紅色色素顆粒多，分生孢子與子囊孢子較多，閉囊殼厚，囊內(nèi)孢子清晰可見(jiàn);轉(zhuǎn)化子S62 菌絲透明且細(xì)小，基本無(wú)色素顆粒，隔膜不明顯，閉囊殼數(shù)少，厚垣孢子較多，有少數(shù)分生孢子;轉(zhuǎn)化子S158 菌絲細(xì)，有少量色素顆粒，部分菌絲透明，隔膜明顯且部分節(jié)間膨大，閉囊殼較多且壁厚，囊內(nèi)孢子不清晰，閉囊殼基本成熟，分生孢子少.

圖3 轉(zhuǎn)化子S62 和S158 菌株的顯微形態(tài)(×200)

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物色價(jià)檢測(cè)

分別測(cè)定了紅曲菌液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)物的色價(jià)，結(jié)果如圖4 所示:在液態(tài)發(fā)酵條件下，與原始菌株S 相比，轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 的色價(jià)均大幅度降低，原始菌株S 的色價(jià)為66.37 U/mL，轉(zhuǎn)化子菌株S158 的色價(jià)為17.62 U/mL，S62 僅為2.71 U/mL，只有原始菌株S 色價(jià)的0.04 倍;固體發(fā)酵的結(jié)果與之類(lèi)似，轉(zhuǎn)化子菌株S62 的色價(jià)為556 .51 U/g，S158 的色價(jià)為724.83 U/g，而原始菌株S 的色價(jià)為1 664.74 U/g.

圖4 轉(zhuǎn)化子和原始菌株液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵的色價(jià)比較

將紅曲菌原始菌株S 與轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158的乙醇浸提液適當(dāng)稀釋后，于300～600nm波長(zhǎng)下進(jìn)行紫外-可見(jiàn)光譜掃描，掃描圖譜見(jiàn)圖5.結(jié)果表明，紅曲菌轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 不僅色價(jià)發(fā)生了明顯下降，而且吸收峰位置也發(fā)生了變化.原始菌株S 有2 個(gè)吸收峰，都在400～500 nm;而轉(zhuǎn)化子菌株S158 雖然有2 個(gè)吸收峰，但其中1 個(gè)吸收峰在500～530 nm 處;轉(zhuǎn)化子菌株S62 只在380～420 nm 左右有1 個(gè)吸收峰.此現(xiàn)象的原因可能是轉(zhuǎn)化子的色素代謝途徑發(fā)生了變化，使色素的組成發(fā)生了改變，這對(duì)色素相關(guān)基因的研究有重要意義.

圖5 原始菌株與轉(zhuǎn)化子的70%乙醇液浸提物的紫外-可見(jiàn)光掃描圖

2.5 桔霉素含量分析

采用薄層色譜法定性分析轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 發(fā)酵液中桔霉素含量的變化，結(jié)果見(jiàn)圖6.

圖6 發(fā)酵液和紅曲米中桔霉素含量的TLC 分析

由圖6 可以看出，紅曲菌轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 發(fā)酵液及紅曲米固體發(fā)酵后，桔霉素含量與原始菌株S 相比發(fā)生了不同程度的變化.S158 的桔霉素含量與原始菌株S 相比，條帶暗了很多;而突變子菌株S62 發(fā)酵液中的桔霉素在254 nm 紫外光照射下幾乎檢測(cè)不到條帶.

3 討論

農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法是一種常用的研究基因功能的反向遺傳學(xué)策略［18］.本實(shí)驗(yàn)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法使T-DNA 插入到紅曲菌基因組，通過(guò)影響某些基因的表達(dá)引起突變，這些突變將會(huì)導(dǎo)致各個(gè)方面的變化，菌株形態(tài)發(fā)生突變是比較直觀的方面，而這些直觀變化又常常和其他的重要改變相關(guān)聯(lián)，如次級(jí)代謝產(chǎn)物的變化等.

本研究發(fā)現(xiàn)，與原始菌株S 相比，轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 菌落形態(tài)的變異主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面:1)菌落顏色有變化.2 株轉(zhuǎn)化子菌株在顏色上發(fā)生了很大的變化，變淡甚至變?yōu)榘咨?2)菌落生長(zhǎng)速度及菌落大小發(fā)生改變.相對(duì)于原始菌株S 的生長(zhǎng)情況，2 株轉(zhuǎn)化子都有明顯的不同.3)氣生菌絲形態(tài)有變化.2 株轉(zhuǎn)化子的菌絲都比原始菌株S 長(zhǎng)且密，呈絨毛狀.4)菌落發(fā)生隆起突變.在不同的培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化子有不同程度的隆起.5)菌落輻射紋或裂紋有變化.原始菌株S 的菌落會(huì)出現(xiàn)明顯裂紋，而2 株轉(zhuǎn)化子的菌落裂紋減少甚至沒(méi)有出現(xiàn).6)菌落顯微特征發(fā)生改變.通過(guò)顯微觀察發(fā)現(xiàn)，2 株轉(zhuǎn)化子的菌絲直徑、色素顆粒、分生孢子及閉囊殼都有明顯的改變.

本實(shí)驗(yàn)對(duì)2 株轉(zhuǎn)化子菌株S62 和S158 產(chǎn)色素及桔霉素的能力進(jìn)行了分析測(cè)定，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)化子菌株產(chǎn)色素及桔霉素的能力發(fā)生了不同程度的變化.這可能是由于T-DNA 插入位點(diǎn)不同或者是插入位點(diǎn)多樣性阻斷了其與不同代謝產(chǎn)物代謝途徑有關(guān)的基因位點(diǎn)所引起的;也可能是紅曲菌的代謝產(chǎn)物存在部分共同的代謝途徑，阻斷了其中的一個(gè)位點(diǎn)，從而影響到其他代謝產(chǎn)物的生成.有研究認(rèn)為，洛伐他汀、紅曲色素和桔霉素三者都是聚酮體合成酶(PKSs)催化合成的產(chǎn)物［19］.若能找到控制桔霉素合成途徑中編碼酶的基因，就有望通過(guò)定點(diǎn)敲除等技術(shù)阻斷桔霉素的生成，同時(shí)不影響甚至促進(jìn)紅曲色素的產(chǎn)生［20］.采用分子生物學(xué)手段改造和利用紅曲菌［21］，使紅曲產(chǎn)品安全地運(yùn)用于食品及其他產(chǎn)品中，今后還應(yīng)在紅曲菌基因組序列及遺傳學(xué)方面進(jìn)行進(jìn)一步的深入研究，利用基因改造技術(shù)獲得高產(chǎn)色素、不產(chǎn)桔霉素的菌種，使之成為安全的食品添加劑.

［1］傅金泉.中國(guó)紅曲及其實(shí)用技術(shù)［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，1997.

［2］Su Yuanchi，Wang J J，Lin T T，et al.Production of the secondary metabolites gamma-aminobutyric acid and monacolin K by Monascus［J］.J Ind Microbiol Biotech，2003，30(1):41-46.

［3］Campoy S，Rumbero A，Martín J F，et al.Characterization of an hyper pigmenting mutant of Monascus purpureus IB1:identification of two novel pigment chemical structures［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2006，70(4):488-496.

［4］Endo A.Monacolin K，a new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus spesies［J］.J Antibiotics，1979，32(3):852-854.

［5］Wang J J，Lee C L，Pan T M.Improvement of monacolin K，γ-aminobutyric acid and citrinin production ratio as a function of environmental conditions of Monascus purpureus NTU 601［J］.J Ind Microbiol Biotech，2003，30(11):669-676.

［6］Gremmels J F，Dresel J，Leistner L.Use of Monascus extracts as an alternative to nitrite in meat products［J］.Fleischwirtschaft，1991，71(3):329-331.

［7］Iizuka H，Lin C R.On the genus Monascus of Asia and its specific characteristics［J］.Adv Biotechnol，1981，2:555-561.

［8］Gremmels J F，Dresel J，Leistner L.Use of Monascus extracts as an alternative to nitrite in meat products［J］.Fleischwirtschaft，1991，71(3):329-331.

［9］宋洪濤，宓鶴鳴，郭濤.中藥紅曲的研究進(jìn)展［J］.藥學(xué)實(shí)踐雜志，1999，17(3):172-174.

［10］Blanc P J，Loret M O，Goma G.Production of citrinin by various species of Monascus［J］.Biotech Lett，1995，17(3):291-294.

［11］Ciegler A，Vesonder R F，Jackson L K.Production of patulin and citrinin from Penicillium expansum［J］.Appl Environ Microbiol，1977，33(4):1004-1006.

［12］李鐘慶，楊曉暾，郭芳.綜觀紅曲與紅曲菌［M］.北京:中國(guó)輕工業(yè)出版社，2009.

［13］Jiang Donghua，Ji Hao，Ye Yan，et al.Studies on screening of higher γ-aminobutyric acid:producing Monascus and optimization of fermentative parameters［J］.Eur Food Res and Technol，2011，232(3):541-547.

［14］Kim H J，Kim J H，Oh H J，et al.Morphology control of Monascus cells and scale-up of pigment fermentation［J］.Process Biochem，2002，38(5):649-655.

［15］Lee B K，Piao Haiyan，Chuang W J.Production of red pigments by Monascus purpureus in solid-state culture［J］.Biotechnol Bioprocess Eng，2002，7(1):21-25.

［16］中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化管理委員會(huì).GB 4926-2008 食品添加劑 紅曲米(粉)［S］.北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

［17］Pastrna L，Blanc P J.Production of citrinin by Monascus ruber submerged culture in chemically defined media［J］.Acta Biotechnol，1996，16(4):315-319.

［18］Shao Yanchun，Ding Yuedi，Zhao Ying，et al.Characteristic analysis of transformants in T-DNA mutation library of Monascus ruber［J］.World J Microbiol Biotechnol，2009，25(6):989-995.

［19］魯佳慧，劉昕，王江海，等.紅曲的生產(chǎn)工藝及Monacolin K 和桔霉素的檢測(cè)［J］.現(xiàn)代食品科技，2006，22(1):144-146.

［20］邵彥春，李利，楊莎，等.根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的定點(diǎn)敲除技術(shù)在紅色紅曲菌中的應(yīng)用［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2009，36(2):231-237.

［21］邵彥春，丁月娣，陳福生，等.TAIL-PCR 法快速分離紅曲霉色素突變株T-DNA 插入位點(diǎn)側(cè)翼序列［J］.微生物學(xué)通報(bào)，2007，34(2):323-326.