超聲波輔助熱水浸提黑木耳多糖工藝的優(yōu)化研究

包鴻慧，于婷婷，盛倩，劉方媛，周睿，楊宏志

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，大慶 163319）

黑木耳（Auricularia auricular）是我國重要的傳統(tǒng)藥食兼用保健型食用菌，其主要生物活性組分——黑木耳多糖，具有調(diào)節(jié)免疫力、降血脂、降血糖、抗?jié)?、抗凝血、抗腫瘤、抗衰老、抗肝炎、抗突變、抗輻射、抗氧化、增強(qiáng)腸胃功能、促進(jìn)血清蛋白生物合成和促進(jìn)淋巴細(xì)胞核酸生物合成等生理功效，備受國內(nèi)外廣泛關(guān)注[1-5]。

傳統(tǒng)黑木耳多糖浸提工藝的研究方法主要集中在熱水浸提法、酸浸提法、堿浸提法等方面。其中酸浸提法和堿浸提法易導(dǎo)致多糖水解、分子糖苷鍵斷裂、活性結(jié)構(gòu)破壞、多糖得率降低；熱水浸提法是一種經(jīng)典工藝，提取方法簡捷環(huán)保、成本低廉，多糖活性較高，但浸提次數(shù)多、收率低、周期較長[5-7]。新興工藝技術(shù)主要涉及到酶法、超微粉碎法、超聲波輔助法以及微波輔助浸提法等工藝技術(shù)[4-9]。但酶法生產(chǎn)成本相對(duì)較高，反應(yīng)條件相對(duì)苛刻；超微粉碎法耗能相對(duì)較高；微波輔助法周期短，但植物細(xì)胞組織破碎劇烈，體系反應(yīng)溫度無法控制，易導(dǎo)致多糖分子裂解；而超聲技術(shù)可產(chǎn)生空化效應(yīng)、熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)以及化學(xué)效應(yīng)等超聲協(xié)同效應(yīng)，促進(jìn)化學(xué)反應(yīng)，加快溶質(zhì)擴(kuò)散溶解滲透，具有簡便快捷、能耗低、效率高、時(shí)間短、提取率高、多糖活性較高等優(yōu)點(diǎn)，在植物活性成分提取方面已得到廣泛的應(yīng)用[10-11]。

因此，實(shí)驗(yàn)以黑龍江省特色脫脂黑木耳微細(xì)粉為原料，通過超聲波輔助熱水浸提工藝技術(shù)，采用3 因素3 水平中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法，優(yōu)化制備了高得率黑木耳多糖，得出了超聲波輔助熱水浸提工藝效果的非線性回歸模型，旨在為黑木耳多糖新的生產(chǎn)工藝及產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用提供理論依據(jù)和實(shí)際參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)原料和試劑

黑木耳：市售，產(chǎn)于黑龍江省伊春市，購于2012年9 月28 日。

葡萄糖、乙醇、正丁醇、三氯甲烷、苯酚、濃硫酸均為分析純 天津市大茂化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

FW100 型高速萬能粉碎機(jī) 天津市泰斯特儀器有限公司；JD1003B-3B 型電子分析天平 沈陽龍騰電子有限公司；DGG-9070A 型電熱鼓風(fēng)干燥機(jī) 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；TDL80- 2B 型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；SHZW2C 型循環(huán)水式多用真空泵 河南鞏義市英峪儀器廠；RE-52A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海精密科學(xué)儀器有限公司；2102PCS 型紫外-可見分光光度計(jì) 尤尼科（上海）儀器有限公司；JY92-Ⅱ型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；冷凍真空干燥器 北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黑木耳多糖提取工藝

參考多糖提取相關(guān)文獻(xiàn)[4]，并進(jìn)行適當(dāng)修改。將黑木耳子實(shí)體依次清理去雜、55 ℃烘干、高速微細(xì)粉碎、脫脂等處理后，過150 目篩，制成黑木耳微細(xì)干粉。準(zhǔn)確稱取一定量的黑木耳細(xì)干粉，按照料液比為1∶36 比例加入一定量的蒸餾水，置于超聲波反應(yīng)槽中，調(diào)整超聲波功率、超聲提取時(shí)間和反應(yīng)槽水浴溫度進(jìn)行超聲提取。反應(yīng)結(jié)束后取出真空抽濾，濾渣用熱蒸餾水洗滌2 次，合并濾液。然后采用4 000 r·min-1離心分離10 min，取上清液測(cè)定多糖含量。合并上清液，減壓濃縮至1/4 體積，加入95%濃度乙醇，低溫（4 ℃）靜置過夜。然后將醇沉液離心分離（4 000 r·min-1，10 min），去上清液，沉淀中加50 mL 蒸餾水使其重新溶解，按1∶1 加入sevag 試劑[12]脫蛋白，然后在5 000 r·min-1下離心5 min，將上清液減壓濃縮至1/2體積后，冷凍干燥，制得黑木耳粗多糖。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的的繪制

參考相關(guān)文獻(xiàn)[4，13]葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備方法。將葡萄糖配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在490 nm 波長下用分光光度計(jì)測(cè)定其吸光值，并繪出濃度-吸光值標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，得出葡萄糖含量（x）與吸光值（y）的關(guān)系式為：y=0.015 4x +0.002 4，方程擬合度R2= 0.999 4，n=7，線性關(guān)系良好。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of glucose

1.2.3 黑木耳多糖含量的測(cè)定[14]

采用苯酚-硫酸法測(cè)定黑木耳多糖的含量。

1.2.4 黑木耳多糖提取率的測(cè)定

多糖提取率（%）= 多糖質(zhì)量/子實(shí)體干重×100%。

1.2.5 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)面分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[15]，固定料液比為1∶36，自然體系pH 條件下，選取浸提時(shí)間（Z1）、浸提溫度（Z2）以及超聲波功率（Z3）三個(gè)因素作為試驗(yàn)因素，以黑木耳多糖提取率作為超聲波輔助強(qiáng)化黑木耳多糖熱水浸提效果的響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。確定三因素水平上限和下限，并對(duì)每一個(gè)因素的水平編碼，得到編碼表1，試驗(yàn)方案及結(jié)果見表2。數(shù)據(jù)處理采用SAS8.2 統(tǒng)計(jì)軟件分析。

表1 中心組合試驗(yàn)因素水平編碼表Table 1 Code of factors and levels

2 結(jié)果與分析

2.1 黑木耳多糖提取的結(jié)果分析

采用Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，試驗(yàn)結(jié)果如表2 所示。

表2 中心組合試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Results of experiments

以黑木耳多糖提取率為Y 值，得出浸提溫度、浸提時(shí)間以及超聲波功率的編碼值為自變量的三元二次回歸方程為：

Y =14.976 7 +0.13X1+1.327 5X2+0.252 5X3-0.755 8X12+0.33X1X2-1.301X22+0.45X1X3-0.18X3X2-0.560 8X32

對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表3 所示：

表3 F 檢驗(yàn)方差分析表Table 3 Results of F-test variance analysis

對(duì)回歸方程失擬性檢驗(yàn)：F2＝3.49＜F0.05（3，2）＝19.16，差異不顯著。對(duì)回歸方程顯著性檢驗(yàn)：F1＝89.77＞F0.01（9，5）＝10.16，差異極顯著。相關(guān)系數(shù)R2=S回/S總=0.993 8。由以上計(jì)算可知：該方程的顯著性水平為0.01，回歸方程與實(shí)際情況擬合較好。將中心處理公式及各因素編碼公式代入，得到欲求的回歸方程為：

從回歸方程各項(xiàng)方差檢驗(yàn)可看出，方程的一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的影響均達(dá)極顯著水平（p<0.01）。各因素對(duì)取代度影響的重要性依次為浸提溫度＞浸提時(shí)間＞超聲波功率。

2.2 交互效應(yīng)及響應(yīng)面分析

固定其中一個(gè)因素為0 水平（即編碼水平為xi=xj=0），通過降維分析，得到另外兩個(gè)因素對(duì)黑木耳多糖提取率的影響關(guān)系。以圖2 為例，令X2=0，得到浸提時(shí)間和超聲波功率交互效應(yīng)方程為：

采用相同的方法，可建立黑木耳多糖提取率與其他任意兩個(gè)因素間的交互效應(yīng)關(guān)系，其結(jié)果如圖2 所示：

圖2 浸提時(shí)間與超聲波功率對(duì)取代度影響的響應(yīng)面圖與等高線圖Fig. 2 Response surface graph and contour map of extraction time and ultrasound power on extraction yield

由圖2 可知，當(dāng)浸提時(shí)間處于編碼范圍值（-1，0.17），超聲波功率的編碼范圍值（-1，0.29）時(shí)，兩者存在顯著增效作用。當(dāng)浸提時(shí)間在編碼值為0.17，超聲波功率在編碼值為0.29 時(shí)，兩者協(xié)同作用達(dá)到最佳。當(dāng)提取溫度處于編碼范圍值（0.17，1），反應(yīng)時(shí)間的編碼范圍值（0.29，1）時(shí)，兩者對(duì)黑木耳多糖提取率有明顯的拮抗作用。

通過等高線的形狀可反映出兩者間交互效應(yīng)的強(qiáng)弱關(guān)系。等高線表明在同一橢圓性的區(qū)域里面，多糖提取率相同。在圖形中間的橢圓型區(qū)域里面，黑木耳多糖提取率最高；黑木耳多糖提取率由中心向兩邊逐漸降低。這主要是由于當(dāng)浸提溫度一定時(shí)，隨著超聲波功率的增加以及浸提時(shí)間的延長，高頻聲波可產(chǎn)生一系列空化效應(yīng)、熱效應(yīng)、機(jī)械效應(yīng)以及化學(xué)效應(yīng)等超聲協(xié)同效應(yīng)，加大體系物料運(yùn)動(dòng)速度，加劇界面分子間碰撞機(jī)率，促進(jìn)植物細(xì)胞壁破裂，加速目標(biāo)有效成分?jǐn)U散、溶解和釋放，生產(chǎn)周期縮短，浸提率提高[4]。但若體系長時(shí)間處于高頻電磁波輻照條件下，過高聲強(qiáng)易導(dǎo)致體系無用氣泡增加，散射衰減和非線性衰減程度上升，破壁作用減弱。同時(shí)超聲效益引起的過強(qiáng)機(jī)械攪拌剪切作用，可導(dǎo)致多糖大分子結(jié)構(gòu)破壞分子糖苷鍵斷裂[5，9-10]，非糖雜質(zhì)溶出，提取液色深粘稠，產(chǎn)物生物活性大大減弱，體系多糖浸出率反而大大降低。

2.3 提取工藝參數(shù)的優(yōu)化與驗(yàn)證

采用3 因素2 次旋轉(zhuǎn)回歸設(shè)計(jì)，SAS8.2 統(tǒng)計(jì)分析軟件分析，試驗(yàn)結(jié)果見表4：

表4 提取工藝參數(shù)優(yōu)化值及驗(yàn)證結(jié)果Table 4 Result and optimal value of extraction technological parameter

由表4 可見：黑木耳多糖提取的最佳工藝條件為浸提時(shí)間21.4 min，浸提溫度75.3 ℃，超聲波功率325 W，黑木耳多糖理論提取率最大為15.38%，實(shí)測(cè)取代度最大值為15.28%，實(shí)測(cè)均值與理論預(yù)測(cè)值誤差率為0.8%＜1%，說明回歸模型擬和性較好。

2.4 不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較分析

將本實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)與相關(guān)文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)報(bào)道數(shù)據(jù)對(duì)比，結(jié)果如表5 可見：

表5 黑木耳多糖提取工藝方法實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)比表Table 5 Comparison on extraction technology of auricular polysaccharide

由表5 可見，采用超聲波輔助熱水浸提黑木耳多糖工藝方法，其多糖提取率（15.28%）高于傳統(tǒng)水提醇沉工藝方法（5.12%～14.06%），與超微粉碎技術(shù)結(jié)合酸法工藝多糖提取率相當(dāng)（15.78%），略低于先超聲處理后沸水浴長時(shí)浸提法以及超微粉碎技術(shù)結(jié)合超聲波協(xié)同纖維素酶提取工藝多糖提取率（16.59%和16.98%），但考慮到提取工藝周期、生態(tài)保護(hù)、能耗、生產(chǎn)成本、產(chǎn)品活性以及工藝繁簡等因素，本實(shí)驗(yàn)方法具有破碎效果好、提取生產(chǎn)周期短、不破壞分子結(jié)構(gòu)、無環(huán)境污染、成本低廉、高效、工藝簡捷以及有利于大規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)而更具優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

3.1 超聲波輔助熱水浸提黑木耳多糖工藝過程中，各因素對(duì)黑木耳多糖提取率影響的重要性依次為浸提溫度＞浸提時(shí)間＞超聲波功率。

3.2 采用Box-Benhnken 的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)面分析法，超聲波輔助熱水浸提黑木耳多糖的最佳提取工藝條件為浸提時(shí)間21.4 min，浸提溫度75.3 ℃，超聲波功率325 W，黑木耳多糖提取率最大值為15.28 %。

3.3 得出了浸提溫度、浸提時(shí)間和超聲波功率三因素對(duì)黑木耳多糖提取率影響的回歸模型為：

Y=-65.555+0.500 3Z1+1.875 9Z2+0.030 6Z3-0.030 2Z12+0.006 6Z1Z2-0.013Z22+0.000 9Z1Z3-0.000 2Z3Z2-0.000 1Z32

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