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    應(yīng)用基因測序方法檢測哮喘兒童的PTEN基因突變

    2013-11-24 02:20:20趙宏霞鐘慧君
    關(guān)鍵詞:內(nèi)含子外顯子基因突變

    趙宏霞,曹 敏,鐘慧君,劉 瑜

    (南方醫(yī)科大學(xué)附屬深圳婦幼保健院 兒內(nèi)科,廣東 深圳518028)

    支氣管哮喘為小兒的常見病、多發(fā)病,近年來其發(fā)病率有逐年增高趨勢,世界范圍內(nèi)兒童哮喘流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示,兒童哮喘患病率較10年前明顯升高,全世界每年因哮喘而死亡的病人數(shù)高達(dá)10萬人,哮喘已成為當(dāng)今世界威脅公共健康最常見的慢性肺部疾病,其造成的社會負(fù)擔(dān)超過艾滋病與肺結(jié)核的總和[1,2]。

    近幾年,哮喘遺傳相關(guān)基因成為研究的熱點(diǎn)。PTEN基因是一個具有雙重特異性磷酸酶活性的腫瘤抑制基因,它在過敏性氣道炎癥中的作用近年來逐漸受到國內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注。韓國學(xué)者Yong等首次報道了PTEN在過敏性炎癥中的作用,指出PTEN可能通過抑制哮喘模型鼠氣道內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞(eosinophils,EOS)脫顆粒和活化,降低IL-4、IL-5的濃度,從而減輕嗜酸性粒細(xì)胞炎癥和氣道高反應(yīng)性[3]。

    本實(shí)驗(yàn)擬對哮喘及健康兒童的PTEN基因第5、第8外顯子進(jìn)行DNA測序分析,檢測其基因突變情況,并計數(shù)外周血EOS,初步探討PTEN基因突變與兒童哮喘的相關(guān)性,及其與外周血EOS的關(guān)系,進(jìn)一步探究兒童哮喘的發(fā)病機(jī)理,為兒童哮喘預(yù)防及控制藥物的藥物研發(fā)等提供一定的理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

    1 對象與方法

    1.1 研究對象及分組

    1.1.1 哮喘組 2011年1月到2011年12月于本院門診隨診的30例哮喘患兒(臨床緩解期),男、女各15例;年齡3-15歲,平均4.8歲。均符合兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn),入組前一周無使用激素及急性感染性疾病病史。

    1.1.2 對照組 2011年1月到2011年12月于本院健康體檢兒童30例,男16例,女14例;年齡3-15歲,平均4.9歲。均無過敏性疾病病史,入組前一周無使用激素及急性感染性疾病病史。

    兩組兒童性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,具有可比性。兩組兒童家長均知情同意參加該項(xiàng)課題研究。

    1.2 方法

    1.2.1 標(biāo)本采集 兩組兒童均于清晨空腹留取外周靜脈血2ml,1ml提取全基因組DNA,-20℃冰箱凍存?zhèn)錂z;其余1ml做血涂片。

    1.2.2 DNA提取 全血1ml加入適當(dāng)體積磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffered Saline,PBS)、蛋白酶-K消化,使用飽和酚及酚-氯仿-異戊醇混合液依次進(jìn)行抽提,提取出的DNA用無水乙醇沉淀,70%乙醇洗滌,干燥后加細(xì)胞裂解液溶解。

    1.2.3 PTEN目的基因擴(kuò)增 exon-5、exon-8引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列祥見表1。

    表1 引物名稱及序列

    PCR反應(yīng)體系總體積為25μl,其中模板DNA1 μl,dNTP 0.25mmol/L,Taq DNA聚合酶0.25μl,引物0.8μmol/L,Mg2+2.5mmol/L。

    反應(yīng)條件:94℃5min預(yù)變性;94℃30s、52℃30s、72℃60s擴(kuò)增40個循環(huán);72℃ 延伸10min。

    取PCR產(chǎn)物10μl在2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳,電泳產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化。

    1.2.4 基因測序 采用美國PE ABI公司310型DNA測序儀進(jìn)行測序。利用DNASIS MAX V3.0軟件對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

    1.2.5 EOS計數(shù) 于400倍高倍鏡下進(jìn)行外周血嗜酸粒細(xì)胞計數(shù)。

    1.2.6 統(tǒng)計學(xué)分析 計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn),計量資料采用t檢驗(yàn),用SPSS 13.0進(jìn)行統(tǒng)計分析,P<0.05差異有顯著意義。

    2 結(jié)果

    2.1 PTEN基因突變與兒童哮喘的關(guān)系

    2.1.1 哮喘組和對照組PTEN基因第5外顯子未發(fā)現(xiàn)存在基因突變。

    2.1.2 哮喘組PTEN基因第8內(nèi)含子的第32個堿基發(fā)生突變,T→G,突變率為83.3%(25/30)。對照組物基因突變。突變位點(diǎn)見圖1所示。

    2.2 外周血EOS計數(shù)結(jié)果

    2.2.1 哮喘組兒童外周血EOS計數(shù)明顯高于對照組兒童,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表2所示。

    2.2.2 哮喘患兒中,根據(jù)有無發(fā)生PTEN基因第8內(nèi)含子突變,分為基因突變組和基因正常組,組間性別、年齡差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。PTEN基因發(fā)生突變的哮喘患兒外周血EOS計數(shù)高于無突變的哮喘兒童,差異顯著(P<0.05),見表3所示。

    圖1 PTEN基因第8內(nèi)含子基因突變位點(diǎn)圖

    表2 哮喘組和對照組兒童外周血EOS計數(shù)比較(±s)

    表2 哮喘組和對照組兒童外周血EOS計數(shù)比較(±s)

    組別 n EOS(×106/L)30 435±108對照組 30 172±83 t 25.632 P<0.哮喘組001

    表3 哮喘患兒中基因突變組和基因正常組外周血EOS計數(shù)比較(±s)

    表3 哮喘患兒中基因突變組和基因正常組外周血EOS計數(shù)比較(±s)

    組別 n EOS(×106/L)26 574±129基因正常組 4 352±86 t 2.703 P<0.02基因突變組

    3 討論

    支氣管哮喘是臨床上最常見的Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)性疾病,是由嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、呼吸道上皮細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等多種炎性細(xì)胞和細(xì)胞組分共同參與的呼吸道慢性炎癥性疾病。其關(guān)鍵的效應(yīng)細(xì)胞是T輔助細(xì)胞和EOS。

    10號染色體上磷酸酶與張力蛋白同源缺失性(PTEN)基因是一個具有雙重特異磷酸酶活性的抑癌基因,其定位于10q23.3上,全長200kb,包含9個外顯子和8個內(nèi)含子,編碼由403個氨基酸組成的細(xì)胞質(zhì)蛋白[4]。PTEN 基因主要通過PIK3/AKT信號途徑的負(fù)性調(diào)節(jié),對細(xì)胞增殖、生長、凋亡、黏附、遷移和血管生長等進(jìn)行調(diào)節(jié)[5]。PTEN基因是人類腫瘤中突變率最高的抑癌基因[6]。目前只第9外顯子未發(fā)現(xiàn)有突變,其中第5及8外顯子有較高突變率。第5外顯子是編碼磷酸酶的功能區(qū),第8外顯子是PTEN的穩(wěn)定性和磷酸酶生物學(xué)活性的調(diào)節(jié)區(qū)。

    近年研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因在非腫瘤性疾病中也發(fā)揮著重要的作用。韓國學(xué)者Yong等首次報道了PTEN在過敏性炎癥中的作用,指出PTEN可能通過抑制哮喘模型鼠氣道內(nèi)EOS脫顆粒和活化,降低IL-4、IL-5濃度,從而減輕嗜酸性粒細(xì)胞炎癥和氣道高反應(yīng)性[2]。有研究發(fā)現(xiàn)PTEN基因通過EOS存活和趨化的負(fù)向調(diào)節(jié)在過敏性炎癥中發(fā)揮重要作用,PTEN可能成為治療嗜酸粒細(xì)胞性疾病的新靶點(diǎn)[7]。也有學(xué)者研究提示PTEN的過表達(dá)可降低嗜酸細(xì)胞陽離子蛋白水平,減輕氣道炎癥和滲出[8]。目前國內(nèi)外對于PTEN基因突變與哮喘的相關(guān)性研究報道相對較少。

    本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用DNA測序法對哮喘及健康兒童PTEN基因第5、第8外顯子進(jìn)行檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn):哮喘組兒童第5、8外顯子無突變;第8內(nèi)含子存在突變,即第32個堿基點(diǎn)突變,T→G,突變率達(dá)83.3%(25/30);健康兒童組第5、第8外顯子、內(nèi)含子均無突變。

    內(nèi)含子是非編碼蛋白質(zhì)序列,隨著對功能基因的逐步深入研究,越來越多的學(xué)者發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子在基因表達(dá)調(diào)控中有著重要的生物學(xué)功能,它不僅對基因表達(dá)有正調(diào)控作用,也存在負(fù)調(diào)控作用,有的內(nèi)含子對基因表達(dá)有雙向調(diào)控作用。在真核生物基因中內(nèi)含子的存在是普遍現(xiàn)象,內(nèi)含子的長度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于外顯子的長度,甚至在人類基因組中非編碼序列占到95%-97%。目前普遍認(rèn)為內(nèi)含子含有增強(qiáng)子或其他順式作用元件,促進(jìn)轉(zhuǎn)錄的起始或延伸,并增加了mRNA在核內(nèi)的穩(wěn)定性,可充當(dāng)啟動子等。內(nèi)含子在基因表達(dá)中具有位置效應(yīng)和方向依賴性,具有選擇剪接功能,內(nèi)含子在選擇剪接過程中可以起標(biāo)點(diǎn)符號作用來分開外顯子,或提供支持選擇剪接機(jī)制的作用。通過選擇性剪接使單一基因產(chǎn)生多種蛋白質(zhì),參與基因轉(zhuǎn)錄、mRNA運(yùn)輸及翻譯等[9]。內(nèi)含子的嵌入增加了基因在轉(zhuǎn)錄過程中多樣性的同時也提高了其靠性。最近研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)含子突變也會影響基因表達(dá)效應(yīng),引起表型顯著改變。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)雌激素受體α(ESRα)基因的內(nèi)含子中存在突變,導(dǎo)致其繁殖和生產(chǎn)性狀發(fā)生改變[10]。胰島素樣生長因子2(IGF2)3號內(nèi)含子的A3072G的突變與豬生長發(fā)育和骨骼構(gòu)成有關(guān)[11]。也有研究發(fā)現(xiàn)抑癌基因p53 7號內(nèi)含子的基因多態(tài)性與口腔腫瘤的發(fā)病有關(guān)[12、13]。隨著分子生物學(xué)理論及技術(shù)的進(jìn)步,推測在內(nèi)含子與外顯子交界處的內(nèi)含子突變會導(dǎo)致外顯子的缺失或內(nèi)含子不被剪切,發(fā)生在內(nèi)含子中間的突變則因激活隱形剪切位點(diǎn)影響正常剪切導(dǎo)致疾病發(fā)生。

    本實(shí)驗(yàn)結(jié)果哮喘兒童組第8內(nèi)含子第32個堿基的突變,我們推測實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的PTEN基因第8內(nèi)含子的單堿基突變,可能通過影響RNA的選擇性剪切,使得該基因編碼了不同蛋白質(zhì),從而改變PTEN基因在哮喘兒童中的表達(dá)效應(yīng)導(dǎo)致哮喘發(fā)生。

    嗜酸性粒細(xì)胞(EOS)是支氣管哮喘的主要效應(yīng)細(xì)胞,聚集活化的EOS可以分泌多種炎性物質(zhì),引起氣道上皮細(xì)胞損傷,導(dǎo)致支氣管平滑肌收縮,微血管滲漏,黏膜水腫,產(chǎn)生氣道高反應(yīng)和哮喘發(fā)作。EOS導(dǎo)致氣道阻塞和氣道結(jié)構(gòu)的改變,也參與氣道炎癥反應(yīng)及氣道重塑,還參與抑制氣道的免疫反應(yīng),EOS在氣道粘膜的浸潤是哮喘重要的組織病理學(xué)特征之一。本實(shí)驗(yàn)中哮喘兒童外周血EOS計數(shù)明顯高于健康兒童,證實(shí)了嗜酸粒細(xì)胞在哮喘發(fā)病中的重要作用。同時本實(shí)驗(yàn)中發(fā)生PTEN基因突變的哮喘患兒外周血EOS計數(shù)較無突變的哮喘患兒高。國外已有多項(xiàng)研究指出PI3K/AKT信號途徑是PTEN基因進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié)的主要途徑[14],PTEN基因可能通過抑制EOS的活化和趨化在哮喘中發(fā)揮重要作用[2,7]。也有研究表明在EOS的激活和趨化過程中炎癥介質(zhì)通過PI3K信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮一定作用[15],β受體激動劑可通過PI3K/AKT信號途徑調(diào)控氣道EOS的凋亡。由此我們推測PTEN基因可能通過PI3K/AKT信號途徑對EOS進(jìn)行負(fù)性調(diào)節(jié),抑制EOS的活化和趨化。由于第8內(nèi)含子的單堿基突變,改變了PTEN基因的表達(dá),影響了它對EOS的負(fù)性調(diào)控功能,使得哮喘患兒外周血的EOS數(shù)量增多,促發(fā)了慢性氣道過敏性炎癥的發(fā)生。

    本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PTEN基因在兒童支氣管哮喘中存在第8內(nèi)含子的單堿基突變,它可能通過對EOS的調(diào)節(jié)在哮喘氣道的過敏性炎癥中發(fā)揮重作用。相信通過后續(xù)對哮喘兒童PTEN基因的進(jìn)一步研究,將為哮喘綜合治療新策略提供更多的可靠依據(jù)。

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