• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    潮州地區(qū)人乳頭瘤病毒52型L1基因多態(tài)性分析

    2013-11-24 02:20:20羅招云楊立業(yè)陳默蕊
    關(guān)鍵詞:基因庫(kù)進(jìn)化樹潮州

    羅招云,陳 強(qiáng),楊立業(yè),林 敏,陳默蕊

    (1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬潮州中心醫(yī)院 檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中心,廣東 潮州521000;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)

    宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤,僅次于乳腺癌占惡性腫瘤的第二位[1]。研究證實(shí)高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)持續(xù)感染是宮頸癌及其癌前病變發(fā)生的最重要危險(xiǎn)因素[2]。目前關(guān)于16及18型HPV的報(bào)道很多,對(duì)52型的研究較少見。HPV52作為HPV16簇群中的成員,具有高度致癌性的HPV型別,在亞洲等地呈現(xiàn)特殊的流行狀況,逐漸引起人們的關(guān)注。HPV52是潮州地區(qū) HR-HPV優(yōu)勢(shì)基因型別(30.55%,1005/3290)[3]。由于 HPV52與不同遺傳背景的宿主相互作用會(huì)引起病毒的變異,影響HPV感染和轉(zhuǎn)歸,了解HPV52基因多態(tài)性將為明確宮頸癌的發(fā)生和運(yùn)用免疫學(xué)策略預(yù)防HPV52相關(guān)疾病提供新的思路。由于源于中國(guó)內(nèi)地的HPV52基因序列較少,本研究在潮州地區(qū)采集女性宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本,進(jìn)行HPV分型和HPV52L1測(cè)序,將所獲得的HPV52L1序列與GenBank基因庫(kù)中的聯(lián)合進(jìn)行系統(tǒng)全面分析,探討HPV52L1基因多態(tài)性。

    1 材料與方法

    1.1 樣本來源 取自2009年8月至2010年8月間潮州地區(qū)農(nóng)村女性宮頸癌篩查的49458份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本(年齡35~60歲,平均46.98歲,均為生育女性,先前均無宮頸手術(shù)史)。先進(jìn)行HR-HPV 13種高危型別的實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩查(杭州博日),陽性者再進(jìn)行21型核酸分子快速導(dǎo)流雜交分型檢測(cè)(凱普生物技術(shù)有限公司)。HR-HPV陽性者同時(shí)進(jìn)行液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(LCT)。LCT檢查采用廣州安必平醫(yī)藥公司提供的制片儀器(LBP-2801)及其配套試劑,以 The Bethesda System(TBS)報(bào)告系統(tǒng)為診斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇單純HPV52型感染陽性的標(biāo)本為研究對(duì)象。

    1.2 標(biāo)本的采集 此次宮頸癌篩查活動(dòng)通過了潮州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。標(biāo)本采集前由受檢者簽署知情同意書。由專科醫(yī)生使用凱普公司專用宮頸刷完成。擴(kuò)陰器暴露宮頸口后,棉拭子擦去分泌物,宮頸刷順時(shí)針?biāo)⑥D(zhuǎn)3~5圈后將宮頸刷保存于樣品管的保存液中。

    1.3 DNA模板的制備 DNA提取試劑盒(凱普公司生物技術(shù)有限公司),標(biāo)本制備按說明書操作。

    1.4 目的序列PCR擴(kuò)增和測(cè)序 HPV52L1PCR以上述提取DNA為模板。HPV52L1引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank基因庫(kù)天津參考株(TJ49-52,ACCESSION:GQ472848)序列設(shè)計(jì)特異性引物,并經(jīng)Primer5.0分子生物學(xué)軟件分析優(yōu)化。參考Gen-Bank基因庫(kù)中HPV52L1區(qū)通用型引物 MY09/MY11, MY09:5’-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3’, MY11: 5 ’-GCMCAGGGWCATA-AYAATGG-3’;因L1基因序列全長(zhǎng)1590bp較長(zhǎng),故將L1分為4個(gè)區(qū)段,自行設(shè)計(jì)HPV52L1區(qū)段特異引物正反向4對(duì),分別為HPV52-L1-1,

    F:5′-CCATTACCTTCGTTACCCACA-3′,

    R:5′-AGGATGCCCACTAATACCC-3′HPV52-L1-2,

    F:5′-GCTTGGAAATCGGTAGGG-3′,R:5′-GCAGTATTGCCAGAGTTAGACC-3′HPV52-L1-3,

    F:5′-AGGGTCTAACTCTGGCAATAC-3′,

    R:5′-CCTGTAGCCCTGCCTGTA-3′HPV52-L1-4,

    F:5′-ATGAAAATTTTAAGGAATACC -3′,

    在2017—2018秋季學(xué)期“生物化學(xué)”課程的教學(xué)中,采用“大班授課、小班研討”、“設(shè)計(jì)問題和案例”、“網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)師生互動(dòng)”、“改變成績(jī)?cè)u(píng)價(jià)體系”等方面的教學(xué)改革,在提高大班型授課效率方面取得了一定成效,并對(duì)上課模式和效果進(jìn)行了無記名問卷調(diào)查,向參與的學(xué)生(參與傳統(tǒng)教學(xué)問卷為120人,參與教學(xué)改革后問卷為110人)提出了5個(gè)問題。

    R:5′-ACATACATAACATGCAAACAAC-3′上述引物均由Invitrogen生物技術(shù)有限公司(上海)合成。PCR擴(kuò)增儀為ABI2700熱循環(huán)儀。L1基因PCR反應(yīng)條件:50μl反應(yīng)體系(包含2μl模板DNA,滅菌去離子水34.0μl,10×PCR Buffer 5.0 μl,dNTPs 4.0μl(0.2mmol/L),DMSO為1μl,引物P1,P2各1.6μl(0.4μmol/L),Taq DNA 聚合酶1U/0.8μl);L1-1反應(yīng)條件為:93℃5min后進(jìn)行循環(huán),93℃1min,52℃1min,72℃1min,36個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。取10μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),觀察結(jié)果并照相。L1-2、L1-3、L1-4的反應(yīng)條件與 L1-1只有第三步的退火溫度不同,分別為 L1-2(52℃),L1-3(57℃),L1-4(57℃),其它步驟與 L1-1完全一致。HPV52 L1PCR反應(yīng)產(chǎn)物送廣州英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司雙向測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。Taq酶、dNTPs、PMD18-T載體為TakaRa公司產(chǎn)品。

    1.5 HPV52L1區(qū)段序列測(cè)定 因L1序列全長(zhǎng)1 590bp較長(zhǎng),故將L1分為4個(gè)區(qū)段,分別用L1-1、L1-2、L1-3、L1-4進(jìn)行 DNA 測(cè)序,測(cè)序后再拼接。利用BLAST將所測(cè)序列與GenBank基因庫(kù)中HPV52序列進(jìn)行比對(duì)。

    1.6 序列分析 通過BioEdit軟件工具向Gen-Bank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)提交,利用BLAST和DNA STAR等在線分析工具對(duì)所獲得序列進(jìn)行分析,將所測(cè)序列與GenBank基因庫(kù)中天津參考株(ACCESSION:GQ472848)的HPV52L1編碼區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)。對(duì)出現(xiàn)的變異進(jìn)行多態(tài)性分析。本研究獲得的73株組成數(shù)據(jù)集,合并全同序列,然后分組。將潮州地區(qū)的HPV52L1變異株基因序列上交NCBI GenBank基因庫(kù)。

    1.7 建立 HPV52-L1進(jìn)化樹 通過BioEdit、Clustal-1.8和 Mega-5.05軟件工具,以及利用 NCBI→BLAST在線分析工具,按照構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的步驟操作。

    2 結(jié)果

    2.1 HPV52L1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果及初步鑒定以選取的101例HPV52單純感染者宮頸脫落細(xì)胞 DNA 為模板,成功獲得 L1-1、L1-2、L1-3、L1-4各83份PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為:L1-1為526bp、L1-2為547bp、L1-3為596 bp、L1-4為560bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后,分別在相應(yīng)位置附近顯示一條特異DNA條帶,其大小與預(yù)期值一致,見圖1。

    圖1 HPV52-L1中4片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

    2.2 HPV52-L1序列測(cè)定和分析 將83份L1-1、L1-2、L1-3、L1-4PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物進(jìn)行正、反雙向測(cè)序,成功獲得正、反各73條 L1-1、L1-2、L1-3、L1-4基因序列,利用BioEdit和DNA STAR等在線分析軟件將 L1-1、L1-2、L1-3、L1-4再拼接成 HPV52 L1全序列。利用DNA STAR/Edit Seq軟件分析,以天津參考株L1編碼區(qū)序列中起始密碼和終止密碼處小片段,找到相對(duì)應(yīng)的起始密碼和終止密碼,起始密碼和終止密碼之間的基因序列就是所測(cè)的L1編碼區(qū)序列,再利用BLAST在線分析工具,將HPV52L1基因序列與GenBank收錄的天津參考株L1編碼區(qū)序列進(jìn)行比對(duì),一致性均為99%。對(duì)73條HPV52L1核苷酸序列進(jìn)行同源性分析,L1基因型內(nèi)核苷酸同源性為99.1%~99.9%,符合分型規(guī)律[4]。

    表1 HPV52-L1基因測(cè)序結(jié)果與潮州地方株比對(duì)堿基突變類型和位置

    2.4 HPV52L1 15組序列進(jìn)化樹之間的關(guān)系 進(jìn)化樹中上部分的潮州地區(qū)的12組編碼序列與廣州的、天津的、浙江等國(guó)內(nèi)的和泰國(guó)、印度等東南亞國(guó)報(bào)道株親緣關(guān)系最近;進(jìn)化樹中下部分的CZ52D416組編碼序列與 TJ49-52(GQ472848)株和 Qv03594(HQ537740)株親緣關(guān)系最近;進(jìn)化樹下部分的2組(CZ52E928、CZ52E136)編碼序列與哥斯達(dá)黎加和德國(guó)等美歐國(guó)家報(bào)道的株親緣關(guān)系最近,見圖2。

    圖2 HPV52-L1 15組序列進(jìn)化樹

    2.5 HPV52不同突變株的Accession號(hào)和73株感染者的LCT結(jié)果 將潮州地區(qū)15株不同的HPV52 L1變異株基因序列上交GenBank基因庫(kù),獲得15株 的 Accession 號(hào),GenBank accession codes:JN874416、JN874417、JN874419 ~ JN874428、JN874430、JN874434、JN874436。為了了解 HPV52 L1變異株的致瘤性,比較不同的HPV52L1變異株群的宮頸病變嚴(yán)重程度差別,其中CZ52A105組中有1例高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(high grade squamous intraepithelial lesions,HSIL),CZ52A277組為1例鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell cancer,SCC)見表2。

    3 討論

    研究表明HPV52在中國(guó)和亞洲婦女中常見[5]。某些地區(qū)甚至高于 HPV16和 HPV18,在上海、四川、廣東等地,高發(fā)態(tài)勢(shì)尤為明顯[6]。HPV52作為HPV16簇群中的成員,是具有高度致癌性的HPV型別之一[7],在亞洲等地呈現(xiàn)特殊的流行狀況。L1基因是HPV晚期結(jié)構(gòu)蛋白基因,有較強(qiáng)的抗原性和免疫原性,能誘導(dǎo)機(jī)體B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體,從而阻斷病毒感染,因而L1蛋白是防治HPV感染基因工程疫苗研究的重要靶抗原[8]。研究證實(shí),不同地域間HPV L1基因存在變異現(xiàn)象[9]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)揚(yáng)州地區(qū)L1基因存在7處變異[10]。本研究發(fā)現(xiàn),潮州地區(qū)HPV52L1基因序列有31處堿基分別出現(xiàn)變異,其中6處由于核苷酸的改變,其編碼氨基酸也相應(yīng)發(fā)生變化;另外25處為同義突變,未影響氨基酸的改變。提示HPV52L1編碼基因中可能存在一系列中國(guó)地區(qū)的高頻率突變位點(diǎn);結(jié)果也提示潮州地區(qū)不同L1基因序列之間存在差異,特別是氨基酸的改變,可能會(huì)造成HPV52L1蛋白免疫原性的差異。有學(xué)者報(bào)道HPV不同的變異株與子宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)程度相關(guān)[11]。HPV16的亞美或非洲變異株比歐洲變異株具有更強(qiáng)的發(fā)生宮頸癌的危險(xiǎn)性[12]。本研究分析了潮州地區(qū)HPV52L1基因的突變譜及主流型,并預(yù)測(cè)了其功能變化。L1蛋白的改變將導(dǎo)致病毒的組裝、感染以及抗原表位的改變,使病毒逃避機(jī)體免疫識(shí)別,從而造成病毒的持續(xù)和重復(fù)感染,促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生[13]。提示L1基因突變?yōu)镠PV52型種系發(fā)生提供了確鑿的資料,也為HPV52型預(yù)防性疫苗研制提供新的思路和基本條件。潮州地區(qū)的L1基因多態(tài)性形成15種突變模式,分為東亞和歐洲2種譜系。主流突變的東亞群L1基因序列多與國(guó)內(nèi)的(廣州、天津、浙江等)和東南亞地區(qū)(泰國(guó)、印度、香港、臺(tái)灣等)報(bào)道的HPV52株同源;歐美群L1基因序列與哥斯達(dá)黎加和德國(guó)等歐美國(guó)家報(bào)道的株親緣關(guān)系最近。說明不僅在不同國(guó)家之間,即便在我國(guó)不同地區(qū)之間和不同檢測(cè)對(duì)象之間,L1基因多態(tài)性也存在較大的差異。

    表2 HPV52不同突變株的Accession號(hào)和LCT結(jié)果(n=73)

    綜上所述,HPV52在亞洲CIN發(fā)生中可能占據(jù)重要地位。本研究探明了潮州地區(qū)HPV52L1基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和變異規(guī)律,為制備適合中國(guó)人群的HPV宮頸癌疫苗提供流行病學(xué)資料和理論依據(jù)。

    [1]Renshaw AA,Young NA,Birdsong GG,et al.Comparison of performance of conventional and ThinPrep gynecologic preparations in the College of American Pathologists Gynecologic Cytology Program[J].Arch Pathol Lab Med,2004,128(1):17.

    [2]趙戴君,龔向真,胡爭(zhēng)光,等.上海市社區(qū)子宮頸人乳頭瘤病毒感染現(xiàn)況及危險(xiǎn)因素研究[J].現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué),2010,37(10):1867.Zhao DJ,Gong XZ,Hu ZG,et al.The prevalence study on the human papillomavirus(HPV)infection and the risk factors of the community female popμlation in Shanghai[J].Modern Preventive Medicine,2010,37(10):1867.

    [3]羅招云,楊立業(yè),翁妙珊,等.潮州地區(qū)人乳頭瘤病毒型別分布特征分析[J].分子診斷與治療雜志,2011,3(3):177.Luo ZY,Yang LY,Weng MS,et al.Analysis of subtypes distribution of human papillomavirus in Chaozhou area[J].Journal of Molecμlar Diagnostics and Therapy,2011,3(3):177.

    [4]Bernard HU,Burk RD,Chen Z,et al.Classification of papillomaviruses(PVs)based on 189PV types and proposal of taxonomic amendments[J].Virology,2010,401:70.

    [5]Onuki M,Matsumoto K,Satoh T,et al.Human papillomavirus infections among Japanese women:age-related prevalence and typespecific risk for cervical cancer[J].Cancer Sci,2009,100(7):1312.

    [6]Lai C H,Huang H J,Hsueh S,et al.Human papillomavirus genotype in cervical cancer:apopμlation-based study[J].Int J Cancer,2007,120(9):1999.

    [7]Bouvard V,Baan R,Straif K,et al.A review of human carcinogens-Part B:biological agents[J].Lancet Oncol,2009,10(4):321.

    [8]劉錫光,劉忠,田厚文,主編.人乳頭瘤病毒感染及其防治[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2009,225-229.Liu XG,Liu Z,Tian HW,chief editor.Infection and preventive of human papillomavirus[M].First published.Beijing:People health publishing company,2009,225-229.

    [9]Icenogle JP,Sathya P,Miller DL,et al.Nucleotide andamino acid sequence variation in the LI and E7open reading frames of human papillomavirus type 6and type 16[J].Virology,1991,184(1):101.

    [10]Mayrand MH,Coutlee F,Hankins C,et al.Detection of human papillomavirus type 16DNA in consecutive genital samples does not always represent persistent infection as determined by molecμlar variant analysis[J].J Clin Microbiol,2000,38:3388.

    [11]Schiffman M,Rodriguez AC,Chen Z,et al.A Popμlation-Based Prospective Study of Carcinogenic Human Papillomavirus Variant Lineages,Viral Persistence,and Cervical Neoplasia[J].Cancer Res,2010,70:3159.

    [12]Sichero L,F(xiàn)erreira S,Trottier H,et al.High grade cervical lesions are caused preferentially by non-European variants of HPVs 16and 18[J].Int J Cancer.2007;120:1763.

    [13]馬正海,張富春,梅新娣,等.新疆南部地區(qū)維吾爾族婦女宮頸癌組織中人乳頭狀瘤病毒16型L1基因突變譜分析[J].中華醫(yī)學(xué)雜志,2004,84(12):987.Ma ZH,Zhang FC,Mei XD,et al.Analysis of Human Papillomavirus 16E6Oncogene Mutation in Xinjiang Uygur Women with Cervical Carcinoma[J].Chinese Medical Journal,2004,84(12):987.

    猜你喜歡
    基因庫(kù)進(jìn)化樹潮州
    天然生物物種基因庫(kù):重慶五里坡國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)
    潮州樂調(diào)的音階流變梳理與分析
    我國(guó)最大藜麥基因庫(kù)落戶山西農(nóng)谷
    基于心理旋轉(zhuǎn)的小學(xué)生物進(jìn)化樹教學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告
    常見的進(jìn)化樹錯(cuò)誤概念及其辨析*
    8個(gè)基因庫(kù)逾萬分種子10月入庫(kù)Svalbard全球種質(zhì)庫(kù)
    潮州手拉壺“飛鴻”的象征意義
    潮州優(yōu)質(zhì)楊梅高接換種技術(shù)
    艾草白粉病的病原菌鑒定
    中國(guó)首個(gè)國(guó)家基因庫(kù)開始運(yùn)營(yíng)
    18在线观看网站| 国产色婷婷99| 亚洲四区av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 精品国产一区二区久久| 黄片无遮挡物在线观看| 久久久亚洲精品成人影院| a级毛片在线看网站| 国产有黄有色有爽视频| 女人久久www免费人成看片| 国产探花极品一区二区| 成年人免费黄色播放视频| 日本黄色日本黄色录像| 精品一品国产午夜福利视频| 亚洲成人一二三区av| 亚洲精品第二区| 亚洲五月色婷婷综合| 人妻少妇偷人精品九色| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 秋霞在线观看毛片| 亚洲三级黄色毛片| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 久久精品国产自在天天线| 爱豆传媒免费全集在线观看| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 丝袜在线中文字幕| 亚洲欧美成人精品一区二区| 满18在线观看网站| 国产成人免费观看mmmm| 久久 成人 亚洲| 国产精品一区www在线观看| 丝瓜视频免费看黄片| 日韩电影二区| 国产免费福利视频在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 日韩 亚洲 欧美在线| 丰满乱子伦码专区| 大码成人一级视频| 人成视频在线观看免费观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 亚洲中文av在线| 久久久久国产网址| 国产精品.久久久| 欧美最新免费一区二区三区| 91精品伊人久久大香线蕉| 大片电影免费在线观看免费| 精品一区二区三区四区五区乱码 | 国精品久久久久久国模美| 啦啦啦视频在线资源免费观看| 天美传媒精品一区二区| 免费av中文字幕在线| 国产精品三级大全| 2018国产大陆天天弄谢| 日韩中文字幕视频在线看片| 国产国语露脸激情在线看| 一级,二级,三级黄色视频| 欧美xxⅹ黑人| 母亲3免费完整高清在线观看 | 久久国内精品自在自线图片| 99久久综合免费| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| √禁漫天堂资源中文www| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 777米奇影视久久| 亚洲国产精品专区欧美| 国产精品一国产av| av免费观看日本| 欧美精品一区二区大全| 久久人妻熟女aⅴ| 亚洲,欧美,日韩| 在线天堂中文资源库| 人妻一区二区av| 不卡视频在线观看欧美| 久久女婷五月综合色啪小说| 国产免费现黄频在线看| 国产男女超爽视频在线观看| 九九在线视频观看精品| 美女大奶头黄色视频| 婷婷色综合大香蕉| 黑人高潮一二区| 成人漫画全彩无遮挡| 欧美bdsm另类| 观看av在线不卡| 免费人妻精品一区二区三区视频| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 热re99久久国产66热| 99香蕉大伊视频| 在线看a的网站| 满18在线观看网站| 日韩一本色道免费dvd| 寂寞人妻少妇视频99o| 在线天堂最新版资源| 免费av不卡在线播放| 99精国产麻豆久久婷婷| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 伦精品一区二区三区| 久久精品国产亚洲av涩爱| 看免费成人av毛片| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 亚洲国产日韩一区二区| av有码第一页| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 久久久久久久久久人人人人人人| 亚洲中文av在线| 午夜视频国产福利| 精品人妻在线不人妻| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 欧美xxⅹ黑人| 国产熟女欧美一区二区| 岛国毛片在线播放| 免费大片黄手机在线观看| 成人午夜精彩视频在线观看| 久久婷婷青草| 99久久人妻综合| 国产深夜福利视频在线观看| 丝袜在线中文字幕| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 精品酒店卫生间| 看免费成人av毛片| 少妇高潮的动态图| 免费高清在线观看日韩| 少妇高潮的动态图| 两个人免费观看高清视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 成年动漫av网址| 少妇的逼水好多| 夜夜爽夜夜爽视频| 久久久久国产精品人妻一区二区| 亚洲精品国产av成人精品| 亚洲人与动物交配视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 免费看av在线观看网站| 男人舔女人的私密视频| 丝瓜视频免费看黄片| 国产在线一区二区三区精| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 在线观看人妻少妇| 久久精品国产a三级三级三级| 国产在线一区二区三区精| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲久久久国产精品| 免费观看在线日韩| 国产精品无大码| 最新中文字幕久久久久| 七月丁香在线播放| 多毛熟女@视频| 亚洲精品乱久久久久久| 久久国产精品男人的天堂亚洲 | 日本黄色日本黄色录像| av不卡在线播放| 一二三四在线观看免费中文在 | 国产精品国产av在线观看| 91精品三级在线观看| 日本免费在线观看一区| 精品人妻偷拍中文字幕| www.色视频.com| 成人影院久久| 男男h啪啪无遮挡| 五月天丁香电影| 曰老女人黄片| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 国产又爽黄色视频| 性高湖久久久久久久久免费观看| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久这里只有精品19| av天堂久久9| 又黄又粗又硬又大视频| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 老女人水多毛片| 亚洲在久久综合| 日本-黄色视频高清免费观看| 成人黄色视频免费在线看| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 一二三四在线观看免费中文在 | 成人综合一区亚洲| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 国产 一区精品| 国产男女内射视频| 亚洲,一卡二卡三卡| 国产精品熟女久久久久浪| 欧美成人午夜精品| av在线app专区| 午夜福利,免费看| 欧美xxⅹ黑人| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 制服诱惑二区| 欧美精品国产亚洲| 天美传媒精品一区二区| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 欧美 日韩 精品 国产| 日韩欧美一区视频在线观看| 宅男免费午夜| 满18在线观看网站| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 激情五月婷婷亚洲| av国产精品久久久久影院| 亚洲成人手机| 九色亚洲精品在线播放| 成人综合一区亚洲| 波野结衣二区三区在线| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产一区二区三区av在线| 七月丁香在线播放| 黄色怎么调成土黄色| 性色av一级| 宅男免费午夜| 亚洲av欧美aⅴ国产| 成人国语在线视频| 青春草亚洲视频在线观看| 日韩欧美精品免费久久| 高清毛片免费看| 五月开心婷婷网| 亚洲激情五月婷婷啪啪| 成人国产麻豆网| 免费大片18禁| 少妇人妻精品综合一区二区| 亚洲欧美色中文字幕在线| videosex国产| 成人手机av| 国产精品欧美亚洲77777| 色婷婷久久久亚洲欧美| 日本91视频免费播放| 免费av不卡在线播放| 国产麻豆69| 好男人视频免费观看在线| 中文字幕亚洲精品专区| 韩国av在线不卡| 国产色爽女视频免费观看| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 波多野结衣一区麻豆| 青青草视频在线视频观看| 韩国高清视频一区二区三区| 午夜免费观看性视频| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 99热国产这里只有精品6| 制服人妻中文乱码| 亚洲四区av| 精品亚洲成a人片在线观看| 日韩,欧美,国产一区二区三区| 国产精品偷伦视频观看了| 国产精品欧美亚洲77777| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 亚洲美女搞黄在线观看| 国产伦理片在线播放av一区| 日韩av不卡免费在线播放| 少妇的逼好多水| 欧美国产精品va在线观看不卡| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 色网站视频免费| 亚洲av.av天堂| 午夜福利视频精品| 国产成人欧美| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 国产男人的电影天堂91| 最近手机中文字幕大全| 久久久久久久亚洲中文字幕| 免费观看av网站的网址| 黑人高潮一二区| 亚洲精品国产av成人精品| 97在线人人人人妻| 国产有黄有色有爽视频| 最近最新中文字幕免费大全7| 又黄又粗又硬又大视频| 国产免费又黄又爽又色| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 久久久久久伊人网av| 亚洲成人手机| 高清在线视频一区二区三区| 色网站视频免费| 日韩中文字幕视频在线看片| 久久久久网色| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| av网站免费在线观看视频| 国国产精品蜜臀av免费| 51国产日韩欧美| 精品一品国产午夜福利视频| 男的添女的下面高潮视频| 少妇的逼好多水| 久久精品夜色国产| 国产毛片在线视频| 成人黄色视频免费在线看| 黄色怎么调成土黄色| 国产精品久久久久久久久免| 国产在线视频一区二区| 欧美日韩精品成人综合77777| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲精品一区蜜桃| 99视频精品全部免费 在线| 久久久久精品久久久久真实原创| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 精品人妻熟女毛片av久久网站| 看非洲黑人一级黄片| av国产久精品久网站免费入址| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久久久久久久久人人人人人人| 我的女老师完整版在线观看| 大香蕉97超碰在线| 美女中出高潮动态图| 精品福利永久在线观看| 精品一区在线观看国产| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产精品国产av在线观看| 日本与韩国留学比较| 国产精品一区二区在线不卡| 妹子高潮喷水视频| 亚洲成色77777| 亚洲av.av天堂| 美女国产高潮福利片在线看| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 激情五月婷婷亚洲| 天堂俺去俺来也www色官网| 久久久久精品人妻al黑| 亚洲伊人久久精品综合| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 久久亚洲国产成人精品v| 日本午夜av视频| 成人无遮挡网站| 夜夜爽夜夜爽视频| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 夫妻午夜视频| 九色亚洲精品在线播放| 久久久欧美国产精品| 观看av在线不卡| 男男h啪啪无遮挡| 精品亚洲成国产av| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产激情久久老熟女| 九色亚洲精品在线播放| 国产伦理片在线播放av一区| 午夜av观看不卡| 男男h啪啪无遮挡| 国产一区有黄有色的免费视频| 22中文网久久字幕| 人人澡人人妻人| 香蕉精品网在线| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 各种免费的搞黄视频| 午夜激情av网站| 宅男免费午夜| 精品国产乱码久久久久久小说| 国产免费一区二区三区四区乱码| 日日啪夜夜爽| 边亲边吃奶的免费视频| 国产亚洲最大av| 国产一级毛片在线| 国产高清不卡午夜福利| 国产男人的电影天堂91| 欧美日韩av久久| 少妇被粗大的猛进出69影院 | 国产视频首页在线观看| 香蕉精品网在线| 久久精品人人爽人人爽视色| 美女国产视频在线观看| 国产黄色视频一区二区在线观看| kizo精华| 91aial.com中文字幕在线观看| 精品国产乱码久久久久久小说| 毛片一级片免费看久久久久| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产精品 国内视频| 久久精品久久精品一区二区三区| 国产在线一区二区三区精| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 欧美精品国产亚洲| 秋霞在线观看毛片| 亚洲中文av在线| 成人国语在线视频| 水蜜桃什么品种好| 欧美+日韩+精品| 亚洲国产精品专区欧美| 五月天丁香电影| 高清视频免费观看一区二区| 桃花免费在线播放| 久久久久网色| 在线精品无人区一区二区三| 亚洲国产精品专区欧美| 久久久久精品性色| 久久久久精品人妻al黑| 一本色道久久久久久精品综合| 亚洲欧美一区二区三区国产| 99re6热这里在线精品视频| 成人国产麻豆网| 9热在线视频观看99| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产成人91sexporn| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 十八禁网站网址无遮挡| 精品国产一区二区久久| 欧美国产精品va在线观看不卡| a级片在线免费高清观看视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 咕卡用的链子| 久久这里有精品视频免费| 美女主播在线视频| 热99国产精品久久久久久7| 久热这里只有精品99| 精品国产乱码久久久久久小说| 老司机影院成人| 日本黄色日本黄色录像| 有码 亚洲区| 久久久久久久大尺度免费视频| 亚洲一码二码三码区别大吗| 天美传媒精品一区二区| 国产色爽女视频免费观看| 只有这里有精品99| 精品国产国语对白av| 18+在线观看网站| 美女国产视频在线观看| 少妇 在线观看| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 九色成人免费人妻av| 久久久久久人人人人人| 永久免费av网站大全| 日日摸夜夜添夜夜爱| 午夜免费男女啪啪视频观看| www.色视频.com| 麻豆乱淫一区二区| 插逼视频在线观看| 久久久久人妻精品一区果冻| 老熟女久久久| 母亲3免费完整高清在线观看 | 国产一区二区在线观看av| 欧美精品亚洲一区二区| 精品酒店卫生间| 国产成人精品婷婷| 另类精品久久| 久久久国产精品麻豆| 国产乱来视频区| 欧美成人午夜精品| 亚洲欧美成人精品一区二区| 国产精品国产三级专区第一集| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 天天影视国产精品| 亚洲av国产av综合av卡| 丰满少妇做爰视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 视频区图区小说| 亚洲精品日本国产第一区| 97超碰精品成人国产| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 狂野欧美激情性bbbbbb| 亚洲人成77777在线视频| 欧美国产精品一级二级三级| 免费看av在线观看网站| 自线自在国产av| 1024视频免费在线观看| 久久精品久久精品一区二区三区| 午夜福利视频在线观看免费| 成人亚洲欧美一区二区av| 免费久久久久久久精品成人欧美视频 | 成人免费观看视频高清| 国产精品成人在线| 久久 成人 亚洲| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 精品久久国产蜜桃| 大片免费播放器 马上看| 国产又爽黄色视频| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 婷婷色综合www| 国产成人午夜福利电影在线观看| 久久这里只有精品19| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲国产日韩一区二区| 成人国语在线视频| 欧美成人午夜精品| 最近最新中文字幕大全免费视频 | 最新中文字幕久久久久| 热99国产精品久久久久久7| 国产一区二区激情短视频 | 99热网站在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 午夜影院在线不卡| 全区人妻精品视频| 丰满迷人的少妇在线观看| 亚洲 欧美一区二区三区| 亚洲国产精品国产精品| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 中文字幕av电影在线播放| 久久狼人影院| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 丰满少妇做爰视频| 国产精品一二三区在线看| 成年人免费黄色播放视频| 男女国产视频网站| 飞空精品影院首页| 欧美xxⅹ黑人| 观看美女的网站| 亚洲国产精品国产精品| 热99久久久久精品小说推荐| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 人妻人人澡人人爽人人| 久久精品国产亚洲av涩爱| 少妇人妻久久综合中文| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 久久久久久久国产电影| 99视频精品全部免费 在线| www.熟女人妻精品国产 | 久久精品aⅴ一区二区三区四区 | 两个人看的免费小视频| 如何舔出高潮| 男的添女的下面高潮视频| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 两个人免费观看高清视频| 色吧在线观看| 丰满饥渴人妻一区二区三| 香蕉丝袜av| 免费大片18禁| 老女人水多毛片| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 亚洲成人手机| 夜夜爽夜夜爽视频| 桃花免费在线播放| 韩国高清视频一区二区三区| 国产免费现黄频在线看| 久久久久久久精品精品| 美女中出高潮动态图| 亚洲av.av天堂| 国产精品国产三级国产专区5o| 波野结衣二区三区在线| 有码 亚洲区| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 一区二区三区精品91| 亚洲四区av| 男女无遮挡免费网站观看| 久久久久视频综合| 999精品在线视频| 国产精品成人在线| 国产精品嫩草影院av在线观看| 一个人免费看片子| 男女下面插进去视频免费观看 | 高清av免费在线| 丝袜喷水一区| 视频在线观看一区二区三区| 国产精品熟女久久久久浪| 国产日韩欧美在线精品| 黄片无遮挡物在线观看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 欧美xxⅹ黑人| 最近手机中文字幕大全| 国产不卡av网站在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 亚洲国产看品久久| 久久久久视频综合| 精品人妻一区二区三区麻豆| 亚洲熟女精品中文字幕| 最近手机中文字幕大全| 久久久久国产网址| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 亚洲第一av免费看| 日韩av在线免费看完整版不卡| 亚洲国产精品一区三区| 在线观看一区二区三区激情| 成人黄色视频免费在线看| 高清av免费在线| 丝袜美足系列| 热99久久久久精品小说推荐| av片东京热男人的天堂| 欧美精品亚洲一区二区| 五月开心婷婷网| 日本色播在线视频| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美人与善性xxx| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 午夜免费观看性视频| 七月丁香在线播放| 欧美亚洲日本最大视频资源| 成人毛片60女人毛片免费| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产又色又爽无遮挡免| 大码成人一级视频| 亚洲精品456在线播放app| 最新的欧美精品一区二区| 人妻少妇偷人精品九色| 99国产综合亚洲精品| 丰满少妇做爰视频| kizo精华| 久久久国产一区二区| 成年女人在线观看亚洲视频| 亚洲av.av天堂| 午夜福利视频在线观看免费| 日本wwww免费看| 亚洲美女搞黄在线观看| 亚洲一区二区三区欧美精品| 在现免费观看毛片| 永久网站在线| av女优亚洲男人天堂| 波野结衣二区三区在线| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片| 97人妻天天添夜夜摸| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 少妇被粗大猛烈的视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 欧美日韩av久久| 十八禁高潮呻吟视频| 女性生殖器流出的白浆| 国产精品人妻久久久影院| 男人爽女人下面视频在线观看| 伦理电影大哥的女人| 久久午夜综合久久蜜桃| 欧美变态另类bdsm刘玥| 精品午夜福利在线看| 欧美成人午夜免费资源| 日韩大片免费观看网站| videossex国产| 亚洲av日韩在线播放| 国产在视频线精品|