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    潮州地區(qū)人乳頭瘤病毒52型L1基因多態(tài)性分析

    2013-11-24 02:20:20羅招云楊立業(yè)陳默蕊
    關(guān)鍵詞:基因庫(kù)進(jìn)化樹潮州

    羅招云,陳 強(qiáng),楊立業(yè),林 敏,陳默蕊

    (1.南方醫(yī)科大學(xué)附屬潮州中心醫(yī)院 檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)中心,廣東 潮州521000;2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院)

    宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤,僅次于乳腺癌占惡性腫瘤的第二位[1]。研究證實(shí)高危型人乳頭瘤病毒(high risk human papillomavirus,HR-HPV)持續(xù)感染是宮頸癌及其癌前病變發(fā)生的最重要危險(xiǎn)因素[2]。目前關(guān)于16及18型HPV的報(bào)道很多,對(duì)52型的研究較少見。HPV52作為HPV16簇群中的成員,具有高度致癌性的HPV型別,在亞洲等地呈現(xiàn)特殊的流行狀況,逐漸引起人們的關(guān)注。HPV52是潮州地區(qū) HR-HPV優(yōu)勢(shì)基因型別(30.55%,1005/3290)[3]。由于 HPV52與不同遺傳背景的宿主相互作用會(huì)引起病毒的變異,影響HPV感染和轉(zhuǎn)歸,了解HPV52基因多態(tài)性將為明確宮頸癌的發(fā)生和運(yùn)用免疫學(xué)策略預(yù)防HPV52相關(guān)疾病提供新的思路。由于源于中國(guó)內(nèi)地的HPV52基因序列較少,本研究在潮州地區(qū)采集女性宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本,進(jìn)行HPV分型和HPV52L1測(cè)序,將所獲得的HPV52L1序列與GenBank基因庫(kù)中的聯(lián)合進(jìn)行系統(tǒng)全面分析,探討HPV52L1基因多態(tài)性。

    1 材料與方法

    1.1 樣本來源 取自2009年8月至2010年8月間潮州地區(qū)農(nóng)村女性宮頸癌篩查的49458份宮頸脫落細(xì)胞標(biāo)本(年齡35~60歲,平均46.98歲,均為生育女性,先前均無宮頸手術(shù)史)。先進(jìn)行HR-HPV 13種高危型別的實(shí)時(shí)熒光定量PCR篩查(杭州博日),陽性者再進(jìn)行21型核酸分子快速導(dǎo)流雜交分型檢測(cè)(凱普生物技術(shù)有限公司)。HR-HPV陽性者同時(shí)進(jìn)行液基薄層細(xì)胞學(xué)檢查(LCT)。LCT檢查采用廣州安必平醫(yī)藥公司提供的制片儀器(LBP-2801)及其配套試劑,以 The Bethesda System(TBS)報(bào)告系統(tǒng)為診斷標(biāo)準(zhǔn)。選擇單純HPV52型感染陽性的標(biāo)本為研究對(duì)象。

    1.2 標(biāo)本的采集 此次宮頸癌篩查活動(dòng)通過了潮州市中心醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。標(biāo)本采集前由受檢者簽署知情同意書。由專科醫(yī)生使用凱普公司專用宮頸刷完成。擴(kuò)陰器暴露宮頸口后,棉拭子擦去分泌物,宮頸刷順時(shí)針?biāo)⑥D(zhuǎn)3~5圈后將宮頸刷保存于樣品管的保存液中。

    1.3 DNA模板的制備 DNA提取試劑盒(凱普公司生物技術(shù)有限公司),標(biāo)本制備按說明書操作。

    1.4 目的序列PCR擴(kuò)增和測(cè)序 HPV52L1PCR以上述提取DNA為模板。HPV52L1引物設(shè)計(jì)根據(jù)GenBank基因庫(kù)天津參考株(TJ49-52,ACCESSION:GQ472848)序列設(shè)計(jì)特異性引物,并經(jīng)Primer5.0分子生物學(xué)軟件分析優(yōu)化。參考Gen-Bank基因庫(kù)中HPV52L1區(qū)通用型引物 MY09/MY11, MY09:5’-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3’, MY11: 5 ’-GCMCAGGGWCATA-AYAATGG-3’;因L1基因序列全長(zhǎng)1590bp較長(zhǎng),故將L1分為4個(gè)區(qū)段,自行設(shè)計(jì)HPV52L1區(qū)段特異引物正反向4對(duì),分別為HPV52-L1-1,

    F:5′-CCATTACCTTCGTTACCCACA-3′,

    R:5′-AGGATGCCCACTAATACCC-3′HPV52-L1-2,

    F:5′-GCTTGGAAATCGGTAGGG-3′,R:5′-GCAGTATTGCCAGAGTTAGACC-3′HPV52-L1-3,

    F:5′-AGGGTCTAACTCTGGCAATAC-3′,

    R:5′-CCTGTAGCCCTGCCTGTA-3′HPV52-L1-4,

    F:5′-ATGAAAATTTTAAGGAATACC -3′,

    在2017—2018秋季學(xué)期“生物化學(xué)”課程的教學(xué)中,采用“大班授課、小班研討”、“設(shè)計(jì)問題和案例”、“網(wǎng)絡(luò)平臺(tái)實(shí)現(xiàn)師生互動(dòng)”、“改變成績(jī)?cè)u(píng)價(jià)體系”等方面的教學(xué)改革,在提高大班型授課效率方面取得了一定成效,并對(duì)上課模式和效果進(jìn)行了無記名問卷調(diào)查,向參與的學(xué)生(參與傳統(tǒng)教學(xué)問卷為120人,參與教學(xué)改革后問卷為110人)提出了5個(gè)問題。

    R:5′-ACATACATAACATGCAAACAAC-3′上述引物均由Invitrogen生物技術(shù)有限公司(上海)合成。PCR擴(kuò)增儀為ABI2700熱循環(huán)儀。L1基因PCR反應(yīng)條件:50μl反應(yīng)體系(包含2μl模板DNA,滅菌去離子水34.0μl,10×PCR Buffer 5.0 μl,dNTPs 4.0μl(0.2mmol/L),DMSO為1μl,引物P1,P2各1.6μl(0.4μmol/L),Taq DNA 聚合酶1U/0.8μl);L1-1反應(yīng)條件為:93℃5min后進(jìn)行循環(huán),93℃1min,52℃1min,72℃1min,36個(gè)循環(huán),最后72℃延伸10min。取10μl PCR反應(yīng)產(chǎn)物在2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),觀察結(jié)果并照相。L1-2、L1-3、L1-4的反應(yīng)條件與 L1-1只有第三步的退火溫度不同,分別為 L1-2(52℃),L1-3(57℃),L1-4(57℃),其它步驟與 L1-1完全一致。HPV52 L1PCR反應(yīng)產(chǎn)物送廣州英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司雙向測(cè)序,對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析。Taq酶、dNTPs、PMD18-T載體為TakaRa公司產(chǎn)品。

    1.5 HPV52L1區(qū)段序列測(cè)定 因L1序列全長(zhǎng)1 590bp較長(zhǎng),故將L1分為4個(gè)區(qū)段,分別用L1-1、L1-2、L1-3、L1-4進(jìn)行 DNA 測(cè)序,測(cè)序后再拼接。利用BLAST將所測(cè)序列與GenBank基因庫(kù)中HPV52序列進(jìn)行比對(duì)。

    1.6 序列分析 通過BioEdit軟件工具向Gen-Bank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)提交,利用BLAST和DNA STAR等在線分析工具對(duì)所獲得序列進(jìn)行分析,將所測(cè)序列與GenBank基因庫(kù)中天津參考株(ACCESSION:GQ472848)的HPV52L1編碼區(qū)序列進(jìn)行比對(duì)。對(duì)出現(xiàn)的變異進(jìn)行多態(tài)性分析。本研究獲得的73株組成數(shù)據(jù)集,合并全同序列,然后分組。將潮州地區(qū)的HPV52L1變異株基因序列上交NCBI GenBank基因庫(kù)。

    1.7 建立 HPV52-L1進(jìn)化樹 通過BioEdit、Clustal-1.8和 Mega-5.05軟件工具,以及利用 NCBI→BLAST在線分析工具,按照構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹的步驟操作。

    2 結(jié)果

    2.1 HPV52L1基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果及初步鑒定以選取的101例HPV52單純感染者宮頸脫落細(xì)胞 DNA 為模板,成功獲得 L1-1、L1-2、L1-3、L1-4各83份PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物,PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為:L1-1為526bp、L1-2為547bp、L1-3為596 bp、L1-4為560bp。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳后,分別在相應(yīng)位置附近顯示一條特異DNA條帶,其大小與預(yù)期值一致,見圖1。

    圖1 HPV52-L1中4片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳圖

    2.2 HPV52-L1序列測(cè)定和分析 將83份L1-1、L1-2、L1-3、L1-4PCR擴(kuò)增陽性產(chǎn)物進(jìn)行正、反雙向測(cè)序,成功獲得正、反各73條 L1-1、L1-2、L1-3、L1-4基因序列,利用BioEdit和DNA STAR等在線分析軟件將 L1-1、L1-2、L1-3、L1-4再拼接成 HPV52 L1全序列。利用DNA STAR/Edit Seq軟件分析,以天津參考株L1編碼區(qū)序列中起始密碼和終止密碼處小片段,找到相對(duì)應(yīng)的起始密碼和終止密碼,起始密碼和終止密碼之間的基因序列就是所測(cè)的L1編碼區(qū)序列,再利用BLAST在線分析工具,將HPV52L1基因序列與GenBank收錄的天津參考株L1編碼區(qū)序列進(jìn)行比對(duì),一致性均為99%。對(duì)73條HPV52L1核苷酸序列進(jìn)行同源性分析,L1基因型內(nèi)核苷酸同源性為99.1%~99.9%,符合分型規(guī)律[4]。

    表1 HPV52-L1基因測(cè)序結(jié)果與潮州地方株比對(duì)堿基突變類型和位置

    2.4 HPV52L1 15組序列進(jìn)化樹之間的關(guān)系 進(jìn)化樹中上部分的潮州地區(qū)的12組編碼序列與廣州的、天津的、浙江等國(guó)內(nèi)的和泰國(guó)、印度等東南亞國(guó)報(bào)道株親緣關(guān)系最近;進(jìn)化樹中下部分的CZ52D416組編碼序列與 TJ49-52(GQ472848)株和 Qv03594(HQ537740)株親緣關(guān)系最近;進(jìn)化樹下部分的2組(CZ52E928、CZ52E136)編碼序列與哥斯達(dá)黎加和德國(guó)等美歐國(guó)家報(bào)道的株親緣關(guān)系最近,見圖2。

    圖2 HPV52-L1 15組序列進(jìn)化樹

    2.5 HPV52不同突變株的Accession號(hào)和73株感染者的LCT結(jié)果 將潮州地區(qū)15株不同的HPV52 L1變異株基因序列上交GenBank基因庫(kù),獲得15株 的 Accession 號(hào),GenBank accession codes:JN874416、JN874417、JN874419 ~ JN874428、JN874430、JN874434、JN874436。為了了解 HPV52 L1變異株的致瘤性,比較不同的HPV52L1變異株群的宮頸病變嚴(yán)重程度差別,其中CZ52A105組中有1例高級(jí)別鱗狀上皮內(nèi)病變(high grade squamous intraepithelial lesions,HSIL),CZ52A277組為1例鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell cancer,SCC)見表2。

    3 討論

    研究表明HPV52在中國(guó)和亞洲婦女中常見[5]。某些地區(qū)甚至高于 HPV16和 HPV18,在上海、四川、廣東等地,高發(fā)態(tài)勢(shì)尤為明顯[6]。HPV52作為HPV16簇群中的成員,是具有高度致癌性的HPV型別之一[7],在亞洲等地呈現(xiàn)特殊的流行狀況。L1基因是HPV晚期結(jié)構(gòu)蛋白基因,有較強(qiáng)的抗原性和免疫原性,能誘導(dǎo)機(jī)體B細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體,從而阻斷病毒感染,因而L1蛋白是防治HPV感染基因工程疫苗研究的重要靶抗原[8]。研究證實(shí),不同地域間HPV L1基因存在變異現(xiàn)象[9]。國(guó)內(nèi)研究發(fā)現(xiàn)揚(yáng)州地區(qū)L1基因存在7處變異[10]。本研究發(fā)現(xiàn),潮州地區(qū)HPV52L1基因序列有31處堿基分別出現(xiàn)變異,其中6處由于核苷酸的改變,其編碼氨基酸也相應(yīng)發(fā)生變化;另外25處為同義突變,未影響氨基酸的改變。提示HPV52L1編碼基因中可能存在一系列中國(guó)地區(qū)的高頻率突變位點(diǎn);結(jié)果也提示潮州地區(qū)不同L1基因序列之間存在差異,特別是氨基酸的改變,可能會(huì)造成HPV52L1蛋白免疫原性的差異。有學(xué)者報(bào)道HPV不同的變異株與子宮頸鱗狀上皮內(nèi)瘤變(cervical intraepithelial neoplasia,CIN)程度相關(guān)[11]。HPV16的亞美或非洲變異株比歐洲變異株具有更強(qiáng)的發(fā)生宮頸癌的危險(xiǎn)性[12]。本研究分析了潮州地區(qū)HPV52L1基因的突變譜及主流型,并預(yù)測(cè)了其功能變化。L1蛋白的改變將導(dǎo)致病毒的組裝、感染以及抗原表位的改變,使病毒逃避機(jī)體免疫識(shí)別,從而造成病毒的持續(xù)和重復(fù)感染,促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生[13]。提示L1基因突變?yōu)镠PV52型種系發(fā)生提供了確鑿的資料,也為HPV52型預(yù)防性疫苗研制提供新的思路和基本條件。潮州地區(qū)的L1基因多態(tài)性形成15種突變模式,分為東亞和歐洲2種譜系。主流突變的東亞群L1基因序列多與國(guó)內(nèi)的(廣州、天津、浙江等)和東南亞地區(qū)(泰國(guó)、印度、香港、臺(tái)灣等)報(bào)道的HPV52株同源;歐美群L1基因序列與哥斯達(dá)黎加和德國(guó)等歐美國(guó)家報(bào)道的株親緣關(guān)系最近。說明不僅在不同國(guó)家之間,即便在我國(guó)不同地區(qū)之間和不同檢測(cè)對(duì)象之間,L1基因多態(tài)性也存在較大的差異。

    表2 HPV52不同突變株的Accession號(hào)和LCT結(jié)果(n=73)

    綜上所述,HPV52在亞洲CIN發(fā)生中可能占據(jù)重要地位。本研究探明了潮州地區(qū)HPV52L1基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和變異規(guī)律,為制備適合中國(guó)人群的HPV宮頸癌疫苗提供流行病學(xué)資料和理論依據(jù)。

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