環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)快速檢測痰標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌的初步評(píng)價(jià)

于 霞，梁 倩，馬異峰，付育紅，黃海榮

（北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院，北京101149）

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的流行最廣的傳染性疾病。全球每年新發(fā)結(jié)核患者800－1000萬，有180萬人死于結(jié)核?。?］。涂片和培養(yǎng)是結(jié)核病診斷最為直接和可靠的診斷依據(jù)，但其自身的不足已嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)室技術(shù)對(duì)結(jié)核病防治的價(jià)值。傳統(tǒng)診斷技術(shù)的不足主要有：（1）診斷技術(shù)敏感性低，涂片鏡檢對(duì)菌陽標(biāo)本的檢出率只有40%－50%。（2）分枝桿菌培養(yǎng)雖然較涂片鏡檢的檢出率高，能達(dá)到85%，但耗時(shí)長，通常需要6－8周。

由于分子生物學(xué)診斷技術(shù)逐步被開發(fā)，其敏感性和特異性以及實(shí)用性已經(jīng)得到認(rèn)可。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)就是其中之一，該技術(shù)通過特異的引物與結(jié)核分枝桿菌染色體DNA的DNA gyrase subunit B （gryB）以 及insertion sequence（IS6110）區(qū)域結(jié)合，采用2對(duì)引物識(shí)別6個(gè)區(qū)域，在恒溫條件下進(jìn)行擴(kuò)增［2］。該技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)為特異性高，擴(kuò)增反應(yīng)效率高，時(shí)間短產(chǎn)物量大，不需昂貴的儀器，操作簡易性好。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本收集 收集本院2012年6－8月的疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本246份。年齡范圍18到88歲，平均年齡49歲，男179份，女67份。經(jīng)臨床診斷確診的結(jié)核病患者標(biāo)本213例，其他肺部疾病標(biāo)本33例。

1.2 分枝桿菌培養(yǎng)和涂片 對(duì)收集的痰標(biāo)本進(jìn)行熒光法涂片鏡檢，痰標(biāo)本的收集和涂片鏡檢按照《痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊》進(jìn)行操作。中性羅氏培養(yǎng)基的制作見參考文獻(xiàn)［3］，取1ml痰標(biāo)本，加入1－1.5倍體積4%用N－乙酰－L－半胱氨酸－氫氧化鈉溶液進(jìn)行消化，旋緊蓋子，在渦旋振蕩器上渦旋震蕩10－20 s，直至痰標(biāo)本充分液化。將離心管室溫靜置15 min，加入PBS中和至體積為40ml，3 000g離心15 min。取100μl處理后的樣品分別接種至中性羅氏培養(yǎng)基斜面上。每份標(biāo)本平行接種至兩管中性羅氏培養(yǎng)基。37℃溫箱培養(yǎng)，每周觀察記錄結(jié)果。

1.3 菌種鑒定 采用杭州創(chuàng)新生物檢控技術(shù)有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌快速診斷試劑盒（膠體金）對(duì)羅氏培養(yǎng)陽性的痰標(biāo)本進(jìn)行菌種鑒定。試劑盒原理為結(jié)核分枝桿菌生長時(shí)產(chǎn)生分泌型蛋白MPB64，而非結(jié)核分枝桿菌（Non－tuberculosis mycobacteria，NTM）不會(huì)產(chǎn)生MPB64。質(zhì)控和測試條帶均為紅色時(shí)，樣本中含結(jié)核分枝桿菌；只有質(zhì)控條帶為紅色時(shí)，樣本中含有NTM。

1.4 實(shí)時(shí)熒光核酸擴(kuò)增（RT－PCR） 采用達(dá)安基因股份有限公司生產(chǎn)的結(jié)核分枝桿菌DNA提取試劑盒進(jìn)行核酸提取，然后按照標(biāo)準(zhǔn)曲線試劑盒進(jìn)行操作，使用實(shí)時(shí)熒光核酸擴(kuò)增儀（ABI7500）進(jìn)行擴(kuò)增，按試劑盒說明進(jìn)行檢測。

1.5 環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）

1.5.1 DNA提取 采用核酸快速提取試劑盒（榮研生物科技（中國）有限公司），該試劑盒通過對(duì)樣本中所含的細(xì)菌進(jìn)行破碎處理，使其所含的核酸游離到溶液中，并將得到的溶液與吸附劑試劑管中的多孔介質(zhì)混合，把樣本中所含的阻礙核酸擴(kuò)增反應(yīng)的物質(zhì)去除，在通過滴注蓋薄膜濾器，使核酸溶液被提取出來。

1.5.2 LAMP擴(kuò)增 將30μl的核酸溶液加到反應(yīng)試管中；將恒溫器在67℃加熱40min；40min后再用加熱器進(jìn)行酶的滅活，80℃，5min。結(jié)果判定：使用紫外照射燈管從反應(yīng)試管的地面進(jìn)行紫外照射。在確認(rèn)陽性對(duì)照發(fā)出綠色熒光，陰性對(duì)照溶液沒有發(fā)出熒光后，對(duì)待測樣本結(jié)果進(jìn)行判讀。陽性：發(fā)出綠色熒光。陰性：未發(fā)出綠色熒光。

1.6 臨床診斷 依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核病學(xué)分會(huì)《肺結(jié)核診斷和治療指南》［4］。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，LAMP與RT－PCR法檢測結(jié)果比較用配對(duì)χ2檢驗(yàn)；LAMP與RT－PCR法檢測結(jié)果一致性分析采用Kappa指數(shù)法，Kappa系數(shù)值越大，說明吻合程度越高。Kappa指數(shù)在0.4－0.7，提示吻合程度一般，大于0.7，說明吻合性強(qiáng)。

2 結(jié)果

2.1 4種方法的檢出率

痰涂片，痰羅氏培養(yǎng)，LAMP擴(kuò)增以及RTPCR四種方法對(duì)分枝桿菌的檢出率依次為30.89%（76／246），45.53%（112／246），54.47%（134／246），57.32%（141／246）。RT－PCR 的檢出率最高，其次為LAMP。LAMP與RT－PCR在結(jié)核分枝桿菌檢出率上的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（配對(duì)χ2檢驗(yàn)結(jié)果，P＝0.189，P＞0.05）。LAMP法與涂片法在結(jié)核分枝桿菌檢出率上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（配對(duì)χ2檢驗(yàn)結(jié)果，P＜0.001）。LAMP法與培養(yǎng)法在結(jié)核分枝桿菌檢出率上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（配對(duì)χ2檢驗(yàn)結(jié)果，P＜0.001）。

2.2 菌種鑒定結(jié)果 對(duì)于羅氏培養(yǎng)陽性的112株分枝桿菌進(jìn)行膠體金試劑盒鑒定，其中7株（7／112，6.25%）株為NTM，其余105株為結(jié)核分枝桿菌。

2.3 LAMP法與羅氏培養(yǎng)法檢測結(jié)果的比較 對(duì)于膠體金鑒定為NTM的7株菌株，在進(jìn)行LAMP法與羅氏培養(yǎng)的比較時(shí)排除這7株菌株。以羅氏培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，LAMP法診斷的敏感性為96.19%（101／105），特異性為76.87%（103／134），兩法檢測結(jié)果的一致性是κ＝0.711，說明LAMP法在檢測結(jié)核分枝桿菌方面與羅氏培養(yǎng)法有較好的吻合性。兩法檢測結(jié)果的比較見表1。

表1 LAMP法與羅氏培養(yǎng)法檢測結(jié)果的比較

2.4 LAMP法與涂片法、RT－PCR法以及臨床診斷結(jié)果的比較

以RT－PCR作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，LAMP法的敏感性為90.07% （127／141），特異性為93.33% （98／105），兩法檢測結(jié)果的一致性是κ＝0.83，說明LAMP法在檢測結(jié)核分枝桿菌方面，與RT－PCR法有很好的吻合性。以涂片結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，LAMP的敏感性為96.05%（73／76），特異性為64.12%（109／170）。以臨床診斷作為金標(biāo)準(zhǔn)，LAMP的敏感性為62.74%（133／212），特異性為97.06%（33／34）。LAMP法與其他3種方法比較，見表2。來自不同臨床診斷類型的痰標(biāo)本，四種不同檢測方法的檢出率如表3所示。

表2 LAMP法與涂片、RT－PCR和臨床診斷結(jié)果的比較

其他非結(jié)核性疾病包括肺癌5例，胸腔積液3例，肺炎4例，支氣管擴(kuò)張合并感染1例，多漿膜腔積液1例。

表3 四種不同檢測方法對(duì)于來自不同臨床診斷類型標(biāo)本的檢出率

3 討論

根據(jù)全國結(jié)核病耐藥性基線調(diào)查報(bào)告，NTM在培養(yǎng)陽性菌株中所占的比例為3.4%［5］。在本研究中，NTM在培養(yǎng)陽性菌株中的比例約6.25%（7／112）%。LAMP技術(shù)的引物設(shè)計(jì)在結(jié)核分枝桿菌染色體DNA的gryB以及IS區(qū)域內(nèi)，從理論上講，只能對(duì)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行診斷而無法識(shí)別NTM菌株。因此計(jì)算LAMP與培養(yǎng)的一致性時(shí)，應(yīng)該先排除NTM菌株的影響。在7株經(jīng)膠體金鑒定為NTM的菌株中有2株的LAMP法和RT－PCR均為陽性且臨床診斷均為結(jié)核病，提示這兩份標(biāo)本可能存在混合感染，即一份痰標(biāo)本中同時(shí)含有結(jié)核和NTM。因此，當(dāng)LAMP結(jié)果為陽性且膠體金為陰性時(shí)，提示檢測樣本可能存在混合感染。

一系列的研究表明，LAMP法與培養(yǎng)法有著較好的吻合率。劉毅［6］等研究表明以培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，選取121份痰標(biāo)本，LAMP法的敏感性和特異性分別為92.16%和87.14%。易海華［7］等研究選取65份痰標(biāo)本，以培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，LAMP法的敏感性和特異性分別為96.4%和94.59%。包維華［8］等研究，選取118份痰標(biāo)本，以培養(yǎng)法為金標(biāo)準(zhǔn)，LAMP法的敏感性和特異性分別92%和86.8%。戴廣明等［9］研究表明選取了79株臨床和標(biāo)準(zhǔn)菌株，與培養(yǎng)相比，LAMP法實(shí)驗(yàn)的靈敏度和特異性分別為100%和92%。Geojith George等研究表明在涂片和培養(yǎng)結(jié)果一致的標(biāo)本中，LAMP方法很有效［10］。同時(shí)，LAMP技術(shù)對(duì)于腦脊液標(biāo)本也有很高的檢出率［11］，與臨床診斷的敏感性和特異性分別為52.9% 和90%。本實(shí)驗(yàn)以羅氏培養(yǎng)結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，LAMP法診斷的敏感性為96.19%（101／105），LAMP的特異性為76.87%（103／134），兩種方法檢測結(jié)果的一致性是κ＝0.71。

痰標(biāo)本的細(xì)菌載量在5000－10000條／ml，涂片鏡檢才會(huì)報(bào)告陽性。而痰培養(yǎng)得細(xì)菌載量在100條／ml以上，培養(yǎng)會(huì)報(bào)告陽性［12］。本實(shí)驗(yàn)所用的LAMP的最低檢出限為0.38基因組／測試。因此，涂片培養(yǎng)陰性并不代表痰標(biāo)本中沒有結(jié)核分枝桿菌，有可能是由于細(xì)菌的數(shù)量低于檢測限造成的。在結(jié)核分枝桿菌檢出率上，LAMP法（134／246，54.47%）要高于涂片法（76／246，30.89%）和羅氏培養(yǎng)法（112／246，45.53%），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

LAMP法與RT－PCR在檢出率上的差別沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＝0.189），兩法檢測結(jié)果的一致性是κ＝0.83。RT－PCR已經(jīng)作為一種輔助檢查項(xiàng)目在國內(nèi)的醫(yī)院廣泛開展，其結(jié)果也可以作為菌陰肺結(jié)核的診斷指標(biāo)之一［4］，檢測時(shí)間約為3個(gè)小時(shí)，但需要價(jià)格較為昂貴的設(shè)備，通過對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)曲線圖譜來判讀結(jié)果，對(duì)操作人員的技術(shù)要求較高。LAMP試劑盒可以在2小時(shí)內(nèi)報(bào)告結(jié)果，且僅需顏色的變化來判讀結(jié)果，操作更為簡單。因此，LAMP法適合作為臨床檢測項(xiàng)目開展。

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