變化波長(zhǎng)高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定鬼箭羽槲皮素和山奈酚的含量

劉 富 謝志民 傅 強(qiáng) 西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院藥學(xué)系（西安710061）

鬼箭羽，學(xué)名：Euonymus alatus（Thunb.）Sieb.，為衛(wèi)矛科衛(wèi)矛屬植物衛(wèi)矛的帶翅嫩枝或枝翅。其性寒，味苦，歸肝經(jīng)，有破血、通經(jīng)、殺蟲(chóng)之功效。主要分布于我國(guó)北部、中部、華北、西南各地區(qū)。其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［1，2］方面僅局限在鑒別方面，隨著時(shí)代的發(fā)展及檢測(cè)技術(shù)的提高，這些項(xiàng)目已不能更好的控制鬼箭羽藥材的質(zhì)量，目前，在“陜西省中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)起草任務(wù)”中，已將藥材鬼箭羽列入其中。本文通過(guò)采用變化波長(zhǎng)HPLC法同時(shí)測(cè)定鬼箭羽中槲皮素和山奈酚的含量［3］，經(jīng)方法學(xué)驗(yàn)證，證明該含量測(cè)定方法精密度、重現(xiàn)性、穩(wěn)定性均良好，可用于鬼箭羽的質(zhì)量控制。

1 儀器與試藥 Agilent HPLC 1260高效液相色譜 儀，Welch Materials C18色 譜 柱 （4.6mm×250mm，5μm），KQ－300VDB型雙頻數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司），BS210S電子天平 （北京賽多利天平有限公司），50g手提式高速中藥粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；槲皮素對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：100081－200907）；山奈酚對(duì)照品（中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：110861－200808）；鬼箭羽藥材經(jīng)西安市食品藥品檢驗(yàn)所中藥室謝志民主任藥師鑒定為衛(wèi)矛科植物Euonymus alatus（Thunb.）Sieb.的翅狀附屬物和其嫩枝。甲醇為色譜純、水為娃哈哈純凈水，其余實(shí)驗(yàn)所用試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果 2.1 色譜條件 色譜柱：Welch Materials C18（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相：以甲醇－磷酸（0.4%）為流動(dòng)相［4］梯度洗脫［5］（0～25min 43：57，25～38min 43→48：57→52，38～50min 48→52：52→48）；流速：1.0mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)：370nm（槲皮素）和367nm（山奈酚）nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。

2.2 溶液的制備 2.2.1對(duì)照品溶液：精密秤取槲皮素對(duì)照品適量，置棕色瓶中，加甲醇制成2.017mg·mL－1的溶液，置（0～4℃）保存，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液；精密秤取山奈酚對(duì)照品適量，置棕色瓶中，加甲醇制成1.415mg·mL－1的溶液，置（0～4℃）保存，作為對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。精密吸取對(duì)照品儲(chǔ)備溶液各1mL，置同一10mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品6號(hào)溶液。

2.2.2 供試品溶液：精密稱(chēng)取鬼箭羽粉末2g，置100mL具塞三角瓶中，精密加入甲醇50mL，稱(chēng)定重量，超聲處理（功率：280W，頻率：45kHz）30min，取出，放冷至室溫，以甲醇補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，棄去初濾液；精密量取續(xù)濾液25mL，精密加入鹽酸2mL，分別加熱回流90min，取出，定量轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，置水浴上蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙?，定量轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，離心（每分鐘4000轉(zhuǎn)），取上清液用微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)，即得。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備 精密吸取對(duì)照品6號(hào)1mL5份，分別置2mL、5mL、10mL、25mL和50mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，分別作為對(duì)照品溶液5～1號(hào)。分別精密吸取1～6號(hào)對(duì)照品溶液各10μL（6號(hào)增加一15μL，1號(hào)增加一5μL）進(jìn)樣3次，在上述色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積平均值為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程。結(jié)果槲皮素和山奈酚的回歸方程分別為：Y＝4853.2x－6.3828，r2＝0.9999；Y＝4732.1x＋1.8806，r2＝0.9999；分別在4.03～40.34μg·mL－1和2.71～27.14μg·mL－1范圍內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.4 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一樣品的供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄槲皮素和山奈酚的色譜峰峰面積，以峰面積計(jì)算得RSD（n＝5）分別為0.76%和1.58%，表明本實(shí)驗(yàn)精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一樣品的供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，分別在0、2、2、4、8、12、16、20、24h進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定槲皮素和山奈酚的色譜峰峰面積，以峰面積計(jì)算RSD（n＝8）分別為0.85%和1.76%，說(shuō)明樣品溶液中槲皮素和山奈酚在24h內(nèi)基本穩(wěn)定，可滿足測(cè)定需要。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批鬼箭羽藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣10μL，測(cè)定含量。計(jì)算槲皮素平均含量為61.08μg／g，RSD＝2.04%；山奈酚平均含量為10.13μg／g，RSD＝1.06%，表明本方法具有較好的重現(xiàn)性。

2.7 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量的供試品9份，分別加入一定量槲皮素和山奈酚對(duì)照品，按供試品溶液的制備方法進(jìn)行處理，按上述色譜方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率。槲皮素的回收率為103.6%（RSD＝1.2%），山奈酚的回收率為97.28%（RSD＝1.7%）。

2.8 樣品含量測(cè)定 精密稱(chēng)取樣品粉末2.0g，按供試品溶液的制備方法和色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積，外標(biāo)法計(jì)算槲皮素和山奈酚的含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論 3.1 供試品制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，按照正交表的要求，對(duì)超聲時(shí)間（20min、30min、40min）、加入鹽酸的量（2mL、3mL、4mL）以及回流時(shí)間（30min、60min、90min）進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，超聲處理30min、加入2mL鹽酸、回流90min，提取效率最高。故采取此方法制備供試品溶液。

3.2 流動(dòng)相選擇 本文曾用乙腈－磷酸0.4%進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果山奈酚峰分離效果不好。故采用本實(shí)驗(yàn)的流動(dòng)相。

3.3 樣品測(cè)定 本文曾對(duì)鬼箭羽枝條進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在鬼箭羽藥材樣品中，槲皮素含量大于山奈酚的含量，而在鬼箭羽枝條中，卻是槲皮素含量少于山萘酚含量。提示鬼箭羽藥材和藥材枝條的含量差別很大，值得注意。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典［M］.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2010：241.

［2］衛(wèi)生部藥政管理局.全國(guó)中藥炮制規(guī)范［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，1988：306.

［3］方振峰，李占林，王 宇，等.中藥鬼箭羽的化學(xué)成分研究Ⅱ［J］.中國(guó)中藥雜志，2008，33（12）：1422.

［4］徐 飛，陸免林，謝 輝，等.HPLC測(cè)定復(fù)方銀杏顆粒中槲皮素、山柰素、異鼠李素及總黃酮醇苷含量［J］.中成藥，2007，29（11）：1617.

［5］王云霞，王敏春，謝志民.HPLC法測(cè)定乳癖散結(jié)顆粒中迷迭香酸的含量［J］.陜西中醫(yī)，2012，33（4）：481.