NS398對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)及CD44V6、MMP-9基因表達(dá)的影響

雙金權(quán) 吳 婷 莊則豪

環(huán)氧合酶-2(cyclooxygenase-2)是環(huán)氧合酶的1種異構(gòu)體，正常生理情況下在機(jī)體多數(shù)組織中不表達(dá)，可被多種刺激物如有絲分裂原、細(xì)胞因子等刺激而表達(dá)［1］。近年來(lái)，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)COX-2在胃癌組織中呈高表達(dá)，且與胃癌的侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)［1，2］，且 COX-2 抑制劑能抑制腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移［3，4］。本實(shí)驗(yàn)觀察了COX-2特異性抑制劑-NS398(分子式C13H18N2O5S，購(gòu)于Cayman Chemical USA)對(duì)胃癌細(xì)胞CD44V6、MMP-9基因表達(dá)的影響，探討COX-2抑制劑抑制胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

人胃腺癌細(xì)胞株SGC7901引自福建醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)教研室。RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司)，新生小牛血清(杭州四季青公司)，NS398(分子式C13H18N2O5S Cayman，USA)，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(Cayman chemical，USA)，Trizol(lifescience technology)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，TaqDNA聚合酶(晶美公司)，DMSO(sigma)，MMP-9、CD44V6單克隆抗體(福州邁新公司)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

SGC7901細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于含10%熱滅活小牛血清的1640培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2～3天0.25%胰酶消化傳代。

1.3 免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè) COX-2、CD44V6、MMP-9蛋白表達(dá)

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SGC7901胃癌細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，苔盼蘭染色細(xì)胞成活率大于98%后，在清潔6孔板的每孔底部平放1片清潔的蓋玻片，再按每孔2×105個(gè)細(xì)胞將胃癌細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后再培養(yǎng)24 h，取出蓋玻片，PBS沖洗數(shù)次，4℃冷丙酮固定10 min，PBS沖洗3次，每次3～5 min。按說(shuō)明書(shū)步驟常規(guī)行S-P法染色。結(jié)果判定:細(xì)胞膜及胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性。

1.4 酶連免疫吸附實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞生長(zhǎng)至培養(yǎng)瓶70%～80%時(shí)更換新鮮培養(yǎng)基，并在實(shí)驗(yàn)組中加入不同量的NS398儲(chǔ)存液使培養(yǎng)液終濃度分別為 1、10、100、200 μmol/L，再繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸取培養(yǎng)上清液 500 μl，12 000 r、4℃離心 5～10 min，去除細(xì)胞碎片。實(shí)驗(yàn)步驟參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。上清液經(jīng)1∶10稀釋后加入檢測(cè)PGE2的96孔板中，各樣本在ELISA檢測(cè)儀中讀取450 nm處的吸光值，并根據(jù)試劑盒中提供的標(biāo)準(zhǔn)蛋白描繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算各樣本的PGE2含量。每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTT檢測(cè)NS398對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的SGC7901胃癌細(xì)胞，胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，按5×103個(gè)細(xì)胞/孔，接種于96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h，更換新鮮培養(yǎng)液并加入NS398，使各組培養(yǎng)液中 NS398濃度分別為 0、50、100、200 μmol/L。分別在加藥后24、48、72 h傾去培養(yǎng)基，每孔加入MTT溶液(5 g/L)20 μL，繼續(xù)孵育4 h。每孔加入150 μL的DMSO，振蕩10 min，應(yīng)用酶連免疫檢測(cè)儀讀取每孔的吸光度(A0)值(λ實(shí)驗(yàn)=490 nm，λ參考=630 nm)。細(xì)胞增殖抑制率(%)=［1－(實(shí)驗(yàn)組)/(對(duì)照組)］×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次、每濃度、每時(shí)間點(diǎn)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.6 總RNA提取

SGC7901胃癌細(xì)胞胰酶消化制成單細(xì)胞懸液，按5×105個(gè)細(xì)胞/瓶，接種于25 ml培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜，待細(xì)胞貼壁后更換培養(yǎng)基，并加入一定量的NS398，使終濃度為 10、100、200 μmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，傾去培養(yǎng)基，0.25%胰酶消化、離心收集細(xì)胞，按105～106個(gè)細(xì)胞/1 ml Trizol加入Trizol，反復(fù)吹打至細(xì)胞完全溶解，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行總RNA提取，測(cè) OD260/OD280≥1.80，說(shuō)明RNA完整性良好，行PCR擴(kuò)增。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)

參照試劑說(shuō)明書(shū)取總RNA 2 μg作逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系 20 μl:mRNA 2 μg，MgCL24 μl，dntp 2 μl ，amv 0.75 μl，oligo 1 μl，rnasin 0.5 μl，distilled water 補(bǔ)足20 μl。反應(yīng)條件:42℃ 1 h，95℃ 5 min。取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物2 μl進(jìn)行PCR反應(yīng)，以β-actin作為內(nèi)參照。參照文獻(xiàn)，各引物序列為:CD44V6［5］(129 bp)，P1:5 ＇-tccaggcaactcctagtagt-3，P2:5-cagctgtccctgttgtcgaa-3。MMP-9［6］(494 bp)，P1:5-tgggagcatggcgatggata-3，P2:5-acagtggacatggcggtctca-3。CD44V6 反應(yīng)體系50 μl:10 × bufferul 5 μl，10 mM dNTP 4 μl，MgCL23 μl(25 mM)，cDNA 2 μl，Taq 酶 2U，β-actin 上下游引物各0.5 μl(10 pmol/μl)，CD44V6 上下游引物各 2 μl(10 pmol/μl)，去離子水補(bǔ)足至 50 μl。在 9 700 型PCR擴(kuò)增儀(Bechman)上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，94℃預(yù)變性5 min后開(kāi)始PCR循環(huán):95℃變性30 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，共擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10 min。MMP-9 反應(yīng)體系50 μl:10 × bufferul 5 μl，10 mM dNTP 4 μl，MgCl23 μl(25 mM)，cDNA 2 μl，Taq 酶 2 U，β-actin 上下游引物各 0.5 μl(10 pmol/μl)，MMP-9上下游引物各2 μl(10 pmol/μl)，去離子水補(bǔ)足至50 μl。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于95℃預(yù)變性5 min后，開(kāi)始PCR熱循環(huán):反應(yīng)條件:95℃45 s，60℃退火 45 s，72℃延伸1 min，共擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)，末次72℃延伸10 min。取8 μl產(chǎn)物加2 μl溴酚蘭混合后經(jīng)0.2%瓊脂糖凝膠電泳，圖像分析儀掃描得出峰值，進(jìn)行半定量分析，以CD44V6/β-actin、MMP-9/β-actin 作為其 mRNA 表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 胃癌細(xì)胞中COX-2、CD44V6、MMP-9表達(dá)情況

免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，COX-2、CD44V6、MMP-9在SGC7901胃癌細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)，其中 COX-2、MMP-9主要是胞質(zhì)染色，CD44V6主要是細(xì)胞膜呈陽(yáng)性染色，且三者表達(dá)強(qiáng)度較強(qiáng)。

2.2 不同濃度NS398對(duì)胃癌細(xì)胞產(chǎn)生PGE2的影響

ELISA試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NS398可有效抑制SGC7901胃癌細(xì)胞PGE2的分泌水平。與對(duì)照組比較，當(dāng)NS398濃度達(dá)10 μmol/L時(shí)，開(kāi)始出現(xiàn) SGC7901胃癌細(xì)胞PGE2分泌水平下降，NS398濃度為200 μmol/L時(shí)能顯著抑制胃癌細(xì)胞PGE2的分泌，PGE2分泌水平下降了64.3%，NS398對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞PGE2分泌水平抑制作用呈濃度相關(guān)性，見(jiàn)表1和圖1。

圖1 NS398作用后胃癌細(xì)胞PGE2分泌水平的變化

表1 不同濃度NS398作用后胃癌細(xì)胞PGE2分泌水平變化

2.3 NS398對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

不同濃度NS398作用不同時(shí)間，實(shí)驗(yàn)組A0值均小于對(duì)照組，而DMSO(200 μmol/L)組與空白對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P＜0.01)，因此，DMSO對(duì)胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)影響。當(dāng)NS398濃度為50 μmol/L時(shí)，SGC7901胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)抑制效應(yīng)，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P＜0.05)。200 μmol/L NS398作用24 h細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率為30.5%，48 h為29.5%，72 h為42.9%。且發(fā)現(xiàn)NS398對(duì)胃癌細(xì)胞增殖抑制率隨其濃度的增高而增高;其中200 μmol/L NS398作用72 h對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率最高，為42.9%，見(jiàn)表2、3。

表2 不同濃度NS398作用不同時(shí)間后對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響

表3 不同濃度NS398作用不同時(shí)間后SGC7901胃癌細(xì)胞增殖抑制率(%)

2.4 NS398對(duì)胃癌細(xì)胞中CD44V6、MMP-9基因表達(dá)的影響

NS398作用24 h后，與對(duì)照組比較，DMSO(200 μmol/L)組CD44V6、MMP-9基因表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P＜0.05)，DMSO 對(duì)胃癌細(xì)胞中 CD44V6、MMP-9基因表達(dá)無(wú)影響;而各實(shí)驗(yàn)組mRNA相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組;200 μmol/L NS398作用24 h時(shí)，胃癌細(xì)胞中CD44V6、MMP-9基因表達(dá)水平分別下降45.7%和43.6%。NS398能在基因表達(dá)水平上抑制 CD44V6、MMP-9表達(dá)，且這種抑制效應(yīng)與 DMSO無(wú)關(guān)，是由NS398 作用引起的，見(jiàn)表4，圖2、3、4。

圖2 SGC7901胃癌細(xì)胞中各目的基因的表達(dá)

表4 NS398對(duì)胃癌細(xì)胞中CD44V6、MMP-9基因表達(dá)的影響(/β-actin)

圖3 NS398作用后SGC7901胃癌細(xì)胞CD44V6基因表達(dá)變化

圖4 NS398作用后SGC7901胃癌細(xì)胞MMP-9基因表達(dá)變化

3 討論

近年研究發(fā)現(xiàn)，COX-2高表達(dá)與胃癌等多種腫瘤發(fā)生有關(guān)，COX-2高表達(dá)不僅促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生，且能促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移［2，7，8］，也有研究發(fā)現(xiàn) COX-2 抑制劑可抑制某些腫瘤細(xì)胞的黏附運(yùn)動(dòng)和侵襲性［4］。

NS398是1種特異性的COX-2抑制劑，可有效抑制前列腺素(PGs)的產(chǎn)生。在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)NS398對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞分泌前列腺素-2(PGE2)水平的影響，發(fā)現(xiàn)NS398可有效抑制SGC7901胃癌細(xì)胞PGE2的產(chǎn)生，且抑制程度隨濃度增加而增強(qiáng)。200 μmol/L NS398作用24 h，胃癌細(xì)胞前列腺素分泌水平下降64.3%。NS398能有效抑制COX-2的PGE2的產(chǎn)生，從而阻斷COX-2的作用。

吳漢平等［9］將COX-2反義RNA轉(zhuǎn)染到胃癌細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)顯著受抑制?？梢?jiàn)COX-2參與了腫瘤生長(zhǎng)的調(diào)控。Cheng等［10］觀察NS398對(duì)肝細(xì)胞癌生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)NS398呈劑量依賴(lài)性抑制Hep3B和HKCI-4細(xì)胞的增殖，100 μmol/L使Hep3B細(xì)胞增殖下降17%，HKCI-4細(xì)胞下降15%。國(guó)內(nèi)王純雁等［11］也觀察到NS398能顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖。MTT試驗(yàn)是1種有效的間接檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)的方法，我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中應(yīng)用MTT法檢測(cè)NS398對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，發(fā)現(xiàn)不同濃度NS398作用不同時(shí)間胃癌細(xì)胞的生長(zhǎng)均受抑制。當(dāng)NS398的濃度為50 μmol/L時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)對(duì)SGC7901胃癌細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，且抑制效應(yīng)隨其濃度增加而增強(qiáng)。其中200 μmol/L作用72 h對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率為42.9%，充分顯示了NS398抑制SGC7901胃癌細(xì)胞體外生長(zhǎng)的效應(yīng)。

腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)的黏附及基質(zhì)的降解是腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要步驟，其中包括黏附分子CD44及基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP-2、MMP-9)的參與。MMP-9能降解基質(zhì)便于腫瘤細(xì)胞的移動(dòng)、侵襲。Yu等［12］認(rèn)為CD44V6作為MMP-9在細(xì)胞表面的附著點(diǎn)，以確保CD44介導(dǎo)的腫瘤浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。Tsujii等［13］發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染COX-2基因的結(jié)腸癌細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的侵襲性，而抑制COX-2表達(dá)可見(jiàn)癌細(xì)胞運(yùn)動(dòng)、侵襲能力下降。Pan等［14］發(fā)現(xiàn)COX-2抑制劑可顯著抑制肺癌細(xì)胞的侵襲、運(yùn)動(dòng)能力及 CD44V6、MMP-2的基因表達(dá)，而對(duì)MMP-9基因表達(dá)無(wú)影響。但Yao等［15］研究發(fā)現(xiàn)COX-2選擇性抑制劑NS398(100 mmol/L)能顯著降低高轉(zhuǎn)移性鼠結(jié)腸癌細(xì)胞MC-26侵襲性，且MMP-2及MMP-9的蛋白表達(dá)水平及酶活性均下降25%～30%，且癌細(xì)胞肝轉(zhuǎn)移被延緩。我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中運(yùn)用RT-PCR檢測(cè)NS398作用于 SGC7901胃癌細(xì)胞24 h后 CD44V6、MMP-9基因表達(dá)水平的變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)NS398作用后，胃癌細(xì)胞CD44V6、MMP-9基因表達(dá)水平有不同程度下降。200 μmol/L NS398 作用 24 h，胃癌細(xì)胞CD44V6、MMP-9基因表達(dá)分別下降45.7%和43.7%。COX-2特異性抑制劑NS398抑制了SGC7901胃癌細(xì)胞CD44V6、MMP-9基因的表達(dá)。CD44V6、MMP-9基因是腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移過(guò)程中的重要分子，因此，COX-2可能在促進(jìn)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的過(guò)程中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用，有可能是調(diào)節(jié)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程的一個(gè)靶點(diǎn)。

NS398可抑制COX-2酶的活性、阻止PGs的產(chǎn)生和釋放，因此，NS398抑制CD44V6、MMP-9表達(dá)與PGs的阻斷有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)［16］，經(jīng)PGs作用后，肺癌細(xì)胞前列腺素的EP4上調(diào)，且伴隨CD44V6、MMP-2基因表達(dá)水平的升高，而抑制 PGs的釋放，可見(jiàn) EP4、CD44V6、MMP-2表達(dá)水平下降;而且發(fā)現(xiàn)若使細(xì)胞內(nèi)cAMP水平升高，則 CD44、MMP-2表達(dá)上調(diào)，可見(jiàn)PGs、EP4、cAMP 參與 COX-2 對(duì) CD44V6、MMP-2 基因表達(dá)的調(diào)節(jié)，而PGs并不能完全逆轉(zhuǎn)這種作用，可能NS398本身對(duì)CD44、MMP-2基因表達(dá)有抑制作用，但具體在胃癌中的作用機(jī)制需進(jìn)一步探討。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)NS398作用SGC7901胃癌細(xì)胞后，其CD44V6、MMP－9基因表達(dá)水平下降，但尚不明確這一作用是否為COX-2依賴(lài)性，其可能的具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究來(lái)明確。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，COX-2特異性抑制劑NS398可抑制CD44V6、MMP-9的基因表達(dá)，而CD44V6、MMP-9是促進(jìn)胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移的重要分子。COX-2及其抑制劑在胃癌侵襲與轉(zhuǎn)移中的作用值得進(jìn)一步研究，COX-2可能是胃癌侵襲、轉(zhuǎn)移調(diào)節(jié)過(guò)程中的一個(gè)新靶點(diǎn)，COX-2特異性抑制劑NS398可能成為新的抑制腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移的藥物。可以設(shè)想，COX-2抑制劑將為胃癌的治療提供新的思路。

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