羅格列酮逆轉(zhuǎn)絲裂霉素對人胃癌SGC7901/VCR細胞株耐藥的作用

胡劍峰 張 琍

多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是導(dǎo)致惡性腫瘤化療失敗和不良預(yù)后的重要原因。Watanabe等［1］應(yīng)用環(huán)孢菌素A(CSA)及其衍生物在體內(nèi)和體外來逆轉(zhuǎn)MDR，證實了環(huán)孢菌素A及其衍生物逆轉(zhuǎn)MDR的作用，由于CSA的細胞毒作用限制了其應(yīng)用。近年來研究表明，過氧化物酶體增殖因子活化受體γ(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARγ)與其配體結(jié)合后可啟動核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與脂肪細胞分化、調(diào)節(jié)糖代謝、調(diào)控細胞周期、抑制炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡等作用［2，3］。本實驗以人胃癌細胞株SCG7901及其耐藥亞系SCG7901/VCR為受試對象，觀察選擇性PPARγ配體羅格列酮逆轉(zhuǎn)MMC對人胃癌SGC7901/VCR細胞株耐藥的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞株

人胃癌多藥耐藥細胞株SGC7901/VCR及其親代SGC7901，均由第四軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院全軍消化研究所樊代明教授惠贈。SGC7901/VCR在終濃度含0.1 g/L VCR的RPMI 1640培養(yǎng)液中連續(xù)傳代培養(yǎng);SGC7901在普通RPMI 1640培養(yǎng)液中連續(xù)傳代培養(yǎng)。

1.2 材料

RPMI 1640培養(yǎng)液及胎牛血清(無支原體級)(Gibco BRL)，長春新堿(Vincristine，VCR)(上海華聯(lián)制藥有限公司)、MTT、胰蛋白酶、絲裂霉素(Mitomycin，MMC)(Sigma，美國)，ROS(浙江萬馬藥業(yè)股份有限公司)，環(huán)孢素A(Cyclosorin A，CSA)(上海華聯(lián)制藥有限公司)。CO2培養(yǎng)箱(美國 Fisher，Scientific 1168751H型)，倒置相差顯微鏡(日本產(chǎn)Nikon TMS)，低溫離心機(美國Beckman J6-HC型)，低溫超速離心機(美國Beckman公司 LE-80型)，PCR儀(德國 Biometra公司T-Gradient Thermoblock PCR型)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng) SGC7901/VCR細胞及 SGC7901細胞分別在終濃度含0.1 g/L VCR的RPMI 1640培養(yǎng)液、RPMI 1640培養(yǎng)液中，置于37℃、50 ml/L CO2條件下培養(yǎng)。用胰蛋白酶消化后收集細胞并傳代。

1.3.2 生長曲線測定 取對數(shù)生長期細胞，制成單細胞懸液，按1×104每瓶接種于25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，4 h細胞貼壁后，加入ROS使其終濃度為20、40、80、160 μmmol/L，對照組加入等量的 DMSO。各實驗組分別加入相應(yīng)藥物。每一濃度組21瓶，每隔24 h各組隨機取3瓶細胞計數(shù)，然后求出3瓶細胞的平均值，連續(xù)7天，以細胞平均數(shù)的對數(shù)為縱坐標、時間為橫坐標繪圖所得曲線為生長曲線。

1.3.3 MTT法測定ROS的細胞毒性、耐藥細胞的耐藥倍數(shù)及逆轉(zhuǎn)倍數(shù) 取對數(shù)生長期的SGC7901細胞和SGC7901/VCR細胞［(1～5)×106/L］接種在96孔板內(nèi)，分別加入相應(yīng)藥物，每孔設(shè)5個平行孔。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，每板均加入不同濃度的MMC使其終濃度為0、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、16.0 mg/L，見表1。MMC濃度梯度參照其常用劑量靜脈推注時在人體達到最高峰值濃度1 mg/L來確定，選擇其最高峰濃度的1/10～16倍［4］。藥物作用48 h后，加入 MTT貯存液10 μl(MTT 按5 mg/L 溶于 pH 7.2 ，0.01M PBS，過濾除菌，4℃避光保存)，37℃、5%CO2培養(yǎng)4 h，棄去各孔內(nèi)液體，每孔加入 100 μl DMSO，振蕩5 min，室溫放置 15 min，于自動酶標儀上測定OD490nm值，取5孔平均值計算細胞生長率、抑制率，確定各組細胞生長抑制50%的藥物濃度即IC50，計算耐藥細胞的逆轉(zhuǎn)倍數(shù):逆轉(zhuǎn)倍數(shù)=耐藥細胞逆轉(zhuǎn)前的IC50/耐藥細胞逆轉(zhuǎn)后的IC50。

表1 MTT法實驗細胞(SGC7901/VCR、SGC7901)分組及給藥情況

1.3.4 集落形成率的測定 取對數(shù)生長期細胞換液后，ROS對照組和ROS增敏組加入ROS使其終濃度為40 μmmol/L，增敏對照組加入CsA使其終濃度為4 μg/L，其余各組加入等體積的DMSO(表2)。培養(yǎng)24 h后MMC處理組及RSG增敏組加入MMC使其終濃度達到1 mg/L，空白對照組及ROS對照組加入等體積的生理鹽水繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，吸去上清液，用0.25%胰酶消化后吸出胰酶，加用培養(yǎng)液吹打成單細胞懸液，鏡下計數(shù)，然后按等比稀釋法制成500個/ml的單細胞懸液，按1 ml/瓶接種到8 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，另加2 ml培養(yǎng)液，每一組3瓶，繼續(xù)培養(yǎng)10天，于倒置顯微鏡低倍觀察集落并計數(shù)，每50個以上的細胞團為一集落，按下列公式計算:集落形成率(%)=集落形成數(shù)/接種細胞數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

表2 集落形成率(SGC7901/VCR、SGC7901)分組及給藥情況

2 結(jié)果

2.1 ROS對人胃癌SGC7901/VCR細胞、SGC7901細胞生長的影響

ROS對SGC7901/VCR細胞及其親代SGC7901細胞生長的影響見圖1、2。兩株人胃癌細胞的對數(shù)生長期都在第2～5天，SGC7901細胞株的生長曲線較為平緩，各濃度ROS對其生長均有一定抑制作用，呈劑量依賴性。SGC7901/VCR細胞株，前2天ROS濃度為20 μM或40 μM時對其生長無明顯影響，第3天開始其生長曲線明顯下降，呈劑量依賴性，當(dāng)ROS濃度為160 μM時，生長曲線從第2天開始就有明顯下降趨勢。

圖1 不同濃度ROS作用后SGC7901/VCR細胞對數(shù)生長曲線

圖2 不同濃度ROS作用后SGC7901細胞對數(shù)生長曲線

2.2 MTT法測定ROS對人胃癌耐藥SGC7901/VCR細胞MMC耐藥性的逆轉(zhuǎn)作用

按照MTT比色法測定OD值，計算細胞抑制率及逆轉(zhuǎn)倍數(shù)，由圖3可知:ROS濃度由0 μmmol/L遞增至80 μmmol/L，MMC對SGC7901/VCR細胞株的半數(shù)抑制濃度由 9.13 mg/L降至 0.87mg/L(P＜0.05)。40 μmmol/L、80 μmmol/L ROS 逆轉(zhuǎn) SGC7901/VCR 細胞對 MMC 的耐藥倍數(shù)(RI)分別為9.6、10.5，與增敏對照組作用相當(dāng)(P＞0.05)。結(jié)果提示ROS能逆轉(zhuǎn)人胃癌多藥耐藥SGC7901/VCR細胞株對MMC的耐藥性，其作用與ROS濃度呈量效關(guān)系。

圖3 ROS增強MMC對SGC7901/VCR細胞生長的抑制作用

2.3 集落形成實驗結(jié)果

每瓶接種500個細胞，每組3瓶，10天后集落計數(shù)。由表3可見:人胃癌SGC7901/VCR細胞的自然集落形成率為53.4%，ROS及MMC對SGC7901/VCR細胞株集落形成無明顯影響，ROS組和MMC組集落形成率分別為44.4%及48.3%，與空白對照組比較，無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);而兩藥合用時集落形成率為24.6%，與空白對照組比較，差異有顯著性(P＜0.05)，與 CSA+MMC 組相當(dāng)(P ＞0.05)。

表3 各藥物對SGC7901/VCR細胞集落形成的影響

3 討論

胃癌(gastric carcinoma)是最常見的惡性腫瘤，在世界上占惡性腫瘤的第二位［5］，胃癌化療抗藥性是胃癌治療中的難題，胃癌細胞的多藥耐藥性(MDR)是胃癌患者化療失敗的根本原因。目前國內(nèi)外研究了多種逆轉(zhuǎn)MDR的方法，如不同的逆轉(zhuǎn)劑、細胞因子、單克隆抗體、核酸技術(shù)等有一定的MDR逆轉(zhuǎn)作用，但同時也出現(xiàn)心臟毒性、免疫抑制、腎毒性以及影響藥代動力學(xué)對正常組織造成更大毒性等毒副作用［6］。

過氧化物酶體增殖因子活化受體(peroxisome pro-liferator-activated receptors，PPARs)是一組核激素受體，與其配體結(jié)合后可啟動核內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄，已發(fā)現(xiàn)有PPARα、PPARβ及 PPARγ 3個成員。PPARγ配體參與脂肪細胞分化、調(diào)節(jié)糖代謝、調(diào)控細胞周期、抑制炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)腫瘤細胞分化和凋亡等作用［2，3］。PPARγ激動劑羅格列酮為FDA批準的臨床治療2型糖尿病藥物，我們的前期工作證實其在體內(nèi)外可抑制人胃癌MGC803細胞及移植瘤的生長，且對荷瘤裸鼠的血糖、肝腎功能及其組織結(jié)構(gòu)無明顯影響［7～10］。本研究探討ROS能否逆轉(zhuǎn)人胃癌細胞的多藥耐藥，擬尋找低毒、有效的MDR逆轉(zhuǎn)劑。

采用藥物濃度梯度法由SGC7901細胞誘導(dǎo)的SGC7901/VCR細胞，對VCR具有明顯的耐受性，能夠在含有1 mg/L VCR的培養(yǎng)基中能持續(xù)增殖，對絲裂霉素 C(mitomycin，MMC)、順鉑(cisplatin，DDP)、阿霉素(adriamycin，ADM)，5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-Fu)產(chǎn)生交叉耐藥，具有明顯的多藥耐藥特點［11］。從生長曲線可知不同濃度的RSG對SGC7901/VCR細胞株及其親代SGC7901細胞株生長抑制作用的動態(tài)變化。ROS對SGC7901/VCR細胞及SGC7901細胞生長均有明顯的抑制作用，并呈量效-時效正相關(guān)。采用MTT法檢測RSG對SGC7901/VCR細胞及SGC7901增殖的影響時發(fā)現(xiàn)，ROS能明顯抑制人胃癌耐藥SGC7901/VCR細胞和SGC7901細胞的生長，并且其抑制作用與RSG的濃度呈依賴關(guān)系，這與生長曲線結(jié)果相一致。集落形成實驗顯示MMC對SGC7901/VCR細胞株集落形成，與空白對照組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，而聯(lián)用ROS則具有較強的集落形成抑制作用。以上研究結(jié)果提示ROS對SGC7901/VCR細胞及SGC7901細胞均有抑制作用，SGC7901/VCR細胞對RSG不具耐藥性。PPARγ配體抑制腫瘤生長機制復(fù)雜，包括誘導(dǎo)凋亡、誘導(dǎo)分化、抑制 cyclinD1、cyclinB、cyclinE、CDK5/p35、CDK4和 CDK2表達，并上調(diào) CD-KIP-1和p27kip1蛋白表達，抑制p27kip1降解，阻滯細胞分裂增殖［12］。

本組結(jié)果提示羅格列酮能夠部分逆轉(zhuǎn)人胃癌多藥耐藥細胞株SGC7901/VCR對MMC的耐藥性，可能為臨床治療胃癌化療耐藥患者提供1種新的途徑。然而，ROS逆轉(zhuǎn)人胃癌SGC7901/VCR細胞的具體機制仍需要進一步探討。

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