用紫外分光光度法和電位滴定法測(cè)定幾種植物激素的電離常數(shù)

朱金花，徐 輝, 2，東瑩瑩, 2，李德亮，劉繡華, 2*

(1.河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 開封 475004； 2.河南大學(xué) 天然藥物與免疫工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004)

植物激素是植物體內(nèi)合成的對(duì)植物生長發(fā)育有顯著作用的微量有機(jī)物，能從產(chǎn)生部位轉(zhuǎn)移到作用部位，在低濃度下就能調(diào)節(jié)植物的生長發(fā)育，幾乎參與了調(diào)控植物生長發(fā)育的每一過程[1]. 植物激素主要包括乙烯、生長素、脫落酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素、茉莉酸、油菜素內(nèi)酯和水楊酸等. 當(dāng)植物受到病原體侵染、害蟲及動(dòng)物的啃咬、干旱及鹽脅迫等生物和非生物的傷害后，植物激素在植物啟動(dòng)防御反應(yīng)的過程中發(fā)揮著巨大的作用[2-4]. 植物激素既可以通過調(diào)控作物生長發(fā)育等過程而直接影響作物產(chǎn)量，又可以通過參與調(diào)控作物對(duì)各種不利條件的適應(yīng)性而減少產(chǎn)量損失，其研究成果對(duì)提高作物產(chǎn)量起到了革命性的推動(dòng)作用，具有較大的農(nóng)業(yè)應(yīng)用價(jià)值，因而植物激素的研究越來越引起人們的重視. 電離常數(shù)是反映離解性物質(zhì)理化性質(zhì)的重要參數(shù)之一，其意義在于它能夠揭示出在任意選定的pH下離解性物質(zhì)分子型和離子型的比例. 測(cè)定脫落酸等植物內(nèi)源激素的電離常數(shù)，可以預(yù)測(cè)它們?cè)谥参矬w內(nèi)的最佳吸收部位和吸收分?jǐn)?shù), 在研究植物生命活動(dòng)的過程中具有重要的實(shí)際意義. 因此，作者對(duì)脫落酸、生長素、赤霉素、水楊酸(分析物結(jié)構(gòu)如圖1所示)四種酸性植物內(nèi)源激素的電離常數(shù)進(jìn)行測(cè)定，為其后續(xù)進(jìn)行含量的準(zhǔn)確測(cè)定提供依據(jù)和參考. 測(cè)定小分子物質(zhì)Ka值的實(shí)驗(yàn)方法有電位滴定法[5-6]、分光光度法[7-9]、電導(dǎo)率法[10]、pH計(jì)法[11]、毛細(xì)管電泳法[12-13]、核磁共振法[14]、薄層色譜法[15-16]、溶解度法等. 毛細(xì)管電泳法、核磁共振法和薄層色譜法所需儀器價(jià)格昂貴，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室均不具備，使其應(yīng)用受到較大的局限性. 由于電位滴定法和紫外分光光度法測(cè)試過程簡單，數(shù)據(jù)處理方便等優(yōu)點(diǎn)，因此，作者采用這兩種方法測(cè)定了這四種植物激素的電離常數(shù).

圖1 分析物結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structures of analytes

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)原理

1.1.1 電位滴定法

電位滴定法是在滴定過程中根據(jù)指示電位和參比電極的電位差或溶液的pH的突躍來確定終點(diǎn)的方法. 在酸堿電位滴定過程中，隨著滴定劑的不斷加入，被測(cè)物與滴定劑發(fā)生反應(yīng)，溶液pH不斷變化，就能確定滴定終點(diǎn).

如將被測(cè)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)式簡寫為RCOOH，則其電離方程為

(1)

電離平衡常數(shù)Ka的定義為

(2)

當(dāng)?shù)味ǚ謹(jǐn)?shù)為50%時(shí)，[RCOO-]=[RCOOH]，此時(shí)有Ka=[H+]，即pKa=pH. 在pH-V曲線上，查出體積相當(dāng)于0.5ΔVep時(shí)的pH，即為該物質(zhì)的pKa.

1.1.2 紫外-可見分光光度法

將被測(cè)物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)式簡寫為RCOOH，將方程式(2)兩邊取對(duì)數(shù)整理，得

(3)

設(shè)溶液的總濃度為[c總]，其值為

[c總]=[RCOOH]+[RCOO-]

(4)

(5)

(6)

RCOOH的電離情況不同，當(dāng)溶液中[RCOOH]和[RCOO-]發(fā)生變化時(shí)，溶液對(duì)紫外光譜的吸收度也隨之發(fā)生變化，因此，溶液中[RCOOH]和[RCOO-]可以由測(cè)定其吸光度間接得到.

由吸光度的可加和性可知，溶液的吸光度為

A=ARCOOH+ARCOO-=εRCOOH[RCOOH]+εRCOO-[RCOO-]

(7)

將(5)、(6)代入(7)得

(8)

(9)

因此，如果配制一系列pH不同，而總濃度[c總]相同的RCOOH溶液，測(cè)出這些溶液的A值，通過計(jì)算則可最終求出RCOOH的電離常數(shù).

1.2 儀器與試劑

紫外可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)，pHS-3D 型酸度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)，堿式滴定管(50 mL). 電子分析天平(北京賽多利斯天平有限公司)，KQ-600DB型數(shù)控超聲波儀(昆山市超聲儀器有限公司)，XK78-1磁力攪拌器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司). 脫落酸(AR)、3-吲哚乙酸(AR)、赤霉素(AR)、水楊酸(AR)購自上海晶純?cè)噭┯邢薰?，磷酸二氫鈉固體、氯化鉀、濃磷酸、NaOH固體、濃鹽酸、甲醇、乙醇及其他所用試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水.

1.3 試劑的配制

①分別稱取一定質(zhì)量的脫落酸、3-吲哚乙酸、赤霉素、水楊酸，用少量乙醇溶解后，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中作為儲(chǔ)備液備用. ②配制1.0 mol/L的氫氧化鈉和1.0 mol/L鹽酸水溶液作為母液備用. ③配制0.2 mol/L的磷酸二氫鈉水溶液備用. 用1.0 mol/L的氫氧化鈉或1.0 mol/L鹽酸水溶液，將磷酸二氫鈉水溶液的pH調(diào)到測(cè)定所需pH. ④用0.2 mol/L KCl和1.0 mol/L HCl配制pH范圍1～2的系列緩沖溶液.

1.4 實(shí)驗(yàn)步驟

1.4.1 電位滴定法

用25 mL的移液管準(zhǔn)確吸取25.00 mL被測(cè)物質(zhì)儲(chǔ)備液至50 mL的燒杯中，放入pHS-3D 型酸度計(jì)復(fù)合玻璃氫電極并攪拌，用堿式滴定管向溶液中滴加0.01 mol/L NaOH溶液，觀察并記錄加入NaOH的體積和溶液的pH. 當(dāng)溶液完全為堿性時(shí)即可停止滴加，重復(fù)測(cè)定三次.

1.4.2 紫外-分光光度法

準(zhǔn)確移取一定體積的分析物儲(chǔ)備液分別置于25 mL比色管中，分別用不同pH的緩沖液定容至25 mL，以蒸餾水作為對(duì)照，于200～400 nm波長范圍掃描，得到濃度相同的分析物溶液在不同pH環(huán)境下的系列吸收曲線. 選擇隨pH的改變?nèi)芤旱奈舛茸兓^大的波長為測(cè)定波長，測(cè)定該波長下不同pH的分析物溶液的吸光度，重復(fù)測(cè)定三次. 根據(jù)吸光度的變化趨勢(shì), 用圖解法計(jì)算分析物的Ka值.

3 結(jié)果與討論

3.1 分析波長的選擇

根據(jù)1.4.2項(xiàng)操作步驟，測(cè)得脫落酸、水楊酸、3-吲哚乙酸、赤霉素的紫外分析波長分別為248、297、279、253 nm.

3.2 分析物pKa的粗測(cè)

用移液管準(zhǔn)確吸取20 mL的分析物儲(chǔ)備液至25 mL的燒杯中，測(cè)量其pH(測(cè)量三次取其平均值). 然后將母液逐級(jí)稀釋，分別測(cè)定濃度為母液的0.5倍、0.25倍、0.125倍等溶液的pH值，記錄測(cè)量結(jié)果. 根據(jù)公式(2)粗略計(jì)算分析物的pKa值(表1). 根據(jù)分析物粗測(cè)pKa結(jié)果，選擇緩沖溶液合適的pH范圍(pKa±2)進(jìn)行紫外分光光度測(cè)定.

表1 pKa的粗略測(cè)定結(jié)果Table 1 The rough value of pKa

3.3 分析物pKa的精確測(cè)定

3.3.1 電位滴定法

用0.01 mol/L NaOH溶液分別滴定脫落酸、3-吲哚乙酸、赤霉素、水楊酸溶液，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)繪制pH-V曲線如圖2所示.

a：脫落酸；b：3-吲哚乙酸；c：赤霉素；d：水楊酸圖2 電位滴定的pH-V曲線Fig.2 The curves of pH-V by potentiometric titration

由圖2可以看出，各物質(zhì)的滴定pH突躍較明顯，且數(shù)據(jù)分布科學(xué)合理，根據(jù)各物質(zhì)滴定數(shù)據(jù)的二階微商，可以計(jì)算得出其滴定終點(diǎn)體積，從pH-V曲線上可得出其對(duì)應(yīng)的pH即為其pKa值. 計(jì)算和測(cè)定結(jié)果如表2所示.

表2 電位滴定測(cè)定結(jié)果Table 2 The result of potentiometric titration method

3.3.2 紫外分光光度法

圖與pH關(guān)系曲線Fig.3 Relationship between and pH

表3 分光光度法測(cè)定結(jié)果Table 3 The result of spectrophotometry method

3.4 方法比較

將電位滴定法和紫外分光光度法所得脫落酸、3-吲哚乙酸、赤霉素和水楊酸的pKa值與文獻(xiàn)報(bào)道值進(jìn)行比較，結(jié)果如表4所示.

表4 實(shí)驗(yàn)測(cè)得數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值的比較Table 4 The comparison of the results with reference

由表4可知，電位滴定法和紫外分光光度法測(cè)得的數(shù)值與文獻(xiàn)報(bào)道值較一致. 用紫外分光光度法測(cè)定3-吲哚乙酸的pKa值與文獻(xiàn)報(bào)道值有一定的差異(標(biāo)準(zhǔn)偏差SD﹥12.84%)，主要原因可能是3-吲哚乙酸水溶液能被紫外光分解所致. 對(duì)于此類物質(zhì)，可選用電位滴定法測(cè)定其電離常數(shù).

4 結(jié)論

采用電位滴定法和分光光度法測(cè)定了脫落酸等四種植物內(nèi)源激素的電離常數(shù)，實(shí)驗(yàn)操作簡單、快速，準(zhǔn)確度高，且重現(xiàn)性較好，所得數(shù)據(jù)為后續(xù)用色譜對(duì)植物激素的定量分析提供參考依據(jù). 從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，電位滴定法和紫外分光光度法相互補(bǔ)充，對(duì)于無法用酸或堿進(jìn)行電位滴定的稀溶液物質(zhì)，可用紫外分光光度法測(cè)定其電離常數(shù)；對(duì)于光吸收的或有色渾濁物質(zhì)，可用電位滴定法測(cè)定其電離常數(shù).

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