利用氫化物發(fā)生-冷阱捕集-原子吸收光譜聯(lián)用技術(shù)測(cè)定雄黃染毒大鼠血中砷的含量

張穎花，高 詠，霍韜光，姜 泓*，孫貴范,3

(1.中國(guó)醫(yī)科大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110001； 2. 沈陽(yáng)市食品藥品檢驗(yàn)所，遼寧 沈陽(yáng) 110013； 3.遼寧省砷生物學(xué)作用與砷中毒重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110001)

雄黃是含砷的常用中藥，臨床應(yīng)用廣泛，同時(shí)也是國(guó)務(wù)院在《醫(yī)療用藥毒性藥品管理辦法》中特別規(guī)定的28種毒性中藥之一. 由于砷是已知毒物，近年，隨著人們用藥安全意識(shí)的提高，有關(guān)雄黃用藥安全性問題受到了國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)界的質(zhì)疑，影響了含雄黃中成藥的國(guó)際聲譽(yù)，由此引發(fā)的雄黃對(duì)人體健康的影響，已成為人們關(guān)注的焦點(diǎn).

無(wú)機(jī)砷(iAs)在體內(nèi)的代謝研究表明[1-2]，iAs在體內(nèi)經(jīng)過(guò)氧化、甲基化和還原過(guò)程，生成一甲基胂酸(MMA)和二甲基胂酸(DMA). 關(guān)于雄黃染毒后體內(nèi)各組織、器官內(nèi)總砷含量的研究報(bào)道較多[3-4]，主要采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法(ICP-MS)、電感耦合等離子體發(fā)射光譜法(ICP-OES)和原子熒光法(AFS)等. 而雄黃在體內(nèi)代謝后的砷形態(tài)的研究報(bào)道較少，作者采用氫化物發(fā)生-冷阱捕集-原子吸收法(HG-CT-AAS)檢測(cè)雄黃染毒后大鼠血液中砷的形態(tài)和含量，為進(jìn)一步研究雄黃進(jìn)入人體后的作用特點(diǎn)和安全性提供依據(jù).

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

氫化物發(fā)生-冷阱捕集-原子吸收分光光度計(jì)(日本島津公司)；pH-3c型酸度計(jì)(上海精密科學(xué)實(shí)業(yè)有限公司)；XW-80A旋渦混合器(上海精科實(shí)業(yè)有限公司)；Easypure純水系統(tǒng)(美國(guó)Barnstead公司).

雄黃(成大方圓藥店)，對(duì)照品iAs、MMA、DMA(Yamanashi公司，日本)的濃度均為1 000μg/L，硫酸為優(yōu)級(jí)純，其他試劑均為分析純.

清潔級(jí)健康4周齡Wistar大鼠32只(中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供)，體重50 ± 10 g，雌雄各半.

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及染毒

按體重隨機(jī)分成4組，每組8只. 以0.5% CMC-Na水溶液為混懸介質(zhì)，實(shí)驗(yàn)組灌胃給予雄黃的劑量分別為0.3、0.9和2.7 g/kg，對(duì)照組給以0.5% CMC-Na水溶液，連續(xù)灌胃6周，每日1次. 在動(dòng)物灌胃期間每3天稱重1次，調(diào)節(jié)灌胃劑量. 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室溫度(24 ± 1)℃，相對(duì)濕度(50 ± 5)%，每天12 h光照，動(dòng)物可自由攝食攝水.

1.3 樣品采集及處理

于末次給藥2 h后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血. 準(zhǔn)確吸取血液0.1 mL，用1.0 mL超純水混懸，加入1.0 mol/L的H2SO42 mL，超聲10 min，作為供試品溶液，備用.

1.4 含量的測(cè)定

將1.3項(xiàng)下制備的溶液分別稀釋至濃度在1～60 μg/L范圍內(nèi)，注入HG-CT-AAS中，檢測(cè)iAs、MMA和DMA. 進(jìn)樣體積為0.5 mL，檢測(cè)波長(zhǎng)為193.3 nm.

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所得數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，用SPSS16.0軟件單因素方差分析方法(ANOVA)進(jìn)行各指標(biāo)組間差異的顯著性檢驗(yàn)，以P<0.05作為檢驗(yàn)的顯著性差異.

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系考察

以對(duì)照品溶液的濃度為橫坐標(biāo)，其峰面積值為縱坐標(biāo)進(jìn)行直線回歸，得線性回歸方程見表1，結(jié)果表明iAs、MMA和DMA在一定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

表1 形態(tài)砷的標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 1 Analysis of calibration standards of arsenic species

2.2 回收率、精密度及檢出限考察

實(shí)驗(yàn)證明，建立的形態(tài)砷分析系統(tǒng)靈敏度高、準(zhǔn)確性好、回收率高. iAs、MMA和DMA的回收率分別為95.1%、97.1%和101.6%；精密度分別為2.3%、3.6%和1.9%；iAs、MMA和DMA的檢出限均為1.0 ng.

2.3 血中形態(tài)砷的測(cè)定

結(jié)果表明，雄黃在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為iAs、MMA和DMA，其中DMA為主要代謝產(chǎn)物，并且隨雄黃染毒劑量的增加各形態(tài)砷水平逐漸升高. (見圖1，表2)

表2 血中形態(tài)砷含量Table 2 Result of arsenic species in blood

注：-表示未檢測(cè)到；*表示與對(duì)照組比，P<0.05

A．對(duì)照品圖，B．供試品圖. 1：iAs (tR=0.576 min)，2：MMA (tR=1.037 min)，3：DMA (tR=1.757 min)圖1 As、MMA和DMA的HG-CT-AAS圖Fig.1 HG-CT-AAS chromatograms of iAs、MMA and DMA

2.4 氫化物發(fā)生-冷阱捕集的原理

硼氫化鈉在酸性溶液(鹽酸)中產(chǎn)生新生態(tài)氫，將樣品中的砷還原成砷化氫氣體. 其中AsⅢ和AsⅤ生成AsH3，MMA生成CH3AsH2, DMA生成(CH3)2AsH. 所生成的砷化氫在載氣(氦氣)的帶動(dòng)下進(jìn)入浸在液氮中的U型玻璃管(內(nèi)填充物為硅藻土)，被低溫捕集，U型玻璃管受熱后，根據(jù)氣體沸點(diǎn)(AsH3為-55 ℃，CH3AsH2為2 ℃，(CH3)2AsH為36.5 ℃)不同依次進(jìn)行分離釋放出來(lái)，而其他樣品基質(zhì)不發(fā)生反應(yīng)被留在廢液中.

2.5 討論

隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，研究者們證實(shí)了iAs經(jīng)甲基化產(chǎn)生的不同形態(tài)砷，又分為不同價(jià)態(tài)，將人們對(duì)砷代謝的認(rèn)識(shí)引入更深的層面. 近年的研究顯示，砷在機(jī)體中生物轉(zhuǎn)化所產(chǎn)生的不同形態(tài)、價(jià)態(tài)砷化物具有不同的毒性和靶器官，其中，三價(jià)有機(jī)砷化物[MMA(III)和DMA(III)]，尤其是MMA(III)毒性最強(qiáng). 體外實(shí)驗(yàn)顯示，幾種砷甲基化產(chǎn)物的細(xì)胞毒性依次為：MMA(III)≥DMA(III)>iAs(III)>iAs(V)>MMA(V)=DMA(V)[5]. 因此，研究雄黃中砷的毒性時(shí)，僅從體內(nèi)總砷的含量不能充分的表明雄黃對(duì)機(jī)體的毒/藥效作用機(jī)制，必須從形態(tài)和價(jià)態(tài)的角度研究其中間代謝產(chǎn)物在體內(nèi)存留的形式和時(shí)間. 但我們?cè)诂F(xiàn)有的檢測(cè)條件下不能對(duì)三價(jià)和五價(jià)砷化合物進(jìn)行區(qū)分，只測(cè)定iAs(III+V)、MMA(III+V)、DMA(III+V).

3 結(jié)論

雄黃在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物為iAs、MMA和DMA，其中DMA是主要代謝產(chǎn)物；HG-CT-AAS法測(cè)定血中形態(tài)砷的含量精密度、準(zhǔn)確度及回收率較高，線性關(guān)系良好.

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