硫脲殼聚糖-銀配合物的制備及其結(jié)構(gòu)和抑菌性能研究

康武魁，孫新枝

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué) 化學(xué)與藥學(xué)院，山東 青島 266109)

殼聚糖(CTS)及其衍生物對(duì)植物病原真菌的孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)均有阻礙作用[1-4]，殼聚糖不僅對(duì)植物無(wú)毒，而且還能誘導(dǎo)寄主植物的種子、果實(shí)和葉片增強(qiáng)抗病性，從而減輕真菌病害的發(fā)生[5-6]. 朱曉紅[7]發(fā)現(xiàn)殼聚糖銅能增強(qiáng)對(duì)某些植物病原菌的抑制作用. 吳慧清[8]發(fā)現(xiàn)合成后的殼聚糖鋅配合物比原來(lái)的殼聚糖溶解度增加了，對(duì)細(xì)菌的抑菌效果增強(qiáng)了，但對(duì)真菌抑菌性能比常規(guī)化學(xué)型防腐劑差一些. 馮小強(qiáng)[9]討論了水溶性殼聚糖和殼聚糖Fe(III)配合物對(duì)E.coli和St.aureus均有顯著的抑菌性能.

對(duì)殼聚糖進(jìn)行改性可以達(dá)到增強(qiáng)其抑菌活性的目的. 硫脲殼聚糖(TU-CTS)，由于其分子結(jié)構(gòu)中含有大量帶孤對(duì)電子的活性基團(tuán)，與多種金屬離子形成金屬配合物，在廢水處理、環(huán)境監(jiān)測(cè)等應(yīng)用領(lǐng)域有誘人的前景，同時(shí)金屬離子具有抗炎、殺菌、抗凝血等作用[10]. 將這兩種有生物活性的物質(zhì)通過(guò)配位反應(yīng)得到一種新型的目標(biāo)化合物，期望該化合物能發(fā)揮協(xié)同效應(yīng). 作者合成了硫脲殼聚糖-Ag配合物，采用紅外光譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并對(duì)其抑菌活性進(jìn)行了研究.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與試劑

殼聚糖(CTS，脫乙酰度 92.5%)浙江玉環(huán)海洋生物化學(xué)有限公司；蘋果腐爛病菌(Valsa mali)、蘋果輪紋病菌(Botyosphaeria berengeriana)、蘋果斑點(diǎn)落葉菌(Alternaria mali Roberts)、番茄灰霉菌(Botrytis cinerea)、葡萄白腐菌(Coniothyrium Diplodiella)均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院提供. 硫脲、硝酸銀、HAc、乙醇、丙酮等其他試劑均為分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

IR200型傅立葉變換紅外光譜儀，美國(guó)Thermo公司；AA-6800原子吸收分光光度計(jì)，日本 Shimadzu公司.

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 硫脲殼聚糖(TU-CTS)的制備[11]

將0.05 mol的硫脲和0.1 mol的殼聚糖(CTS)加入到100 mL無(wú)水乙醇中，攪拌回流12～16 h，產(chǎn)物冷卻至室溫，過(guò)濾，濾餅經(jīng)無(wú)水乙醇洗滌后溶于500 mL體積分?jǐn)?shù)1%的HAc溶液，溶解均勻后，在快速攪拌下緩慢加入約150 mL 10% NaOH溶液中，沉淀，過(guò)濾，用蒸餾水洗至中性，40 ℃干燥，得硫脲殼聚糖.

1.3.2 硫脲殼聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)的制備[11]

將0.5 g硫脲殼聚糖(TU-CTS)溶于50 mL 體積分?jǐn)?shù)為1%的HAc溶液中. 分別將10 mL含有0.001 g(TUCTS-Ag-1)，0.005 g(TUCTS-Ag-2)，0.01 g(TUCTS-Ag-3)，0.02 g AgNO3(TUCTS-Ag-4)的溶液緩慢滴入50 mL溶解均勻的硫脲殼聚糖HAc溶液中，同時(shí)用黑色物品將燒瓶遮光防止Ag+被還原，室溫下攪拌反應(yīng)3～5 h后，200 mL丙酮沉淀，95%乙醇多次淋洗沉淀，過(guò)濾，用 NaCl溶液檢驗(yàn)濾液中是否有Ag+殘留至無(wú)AgCl沉淀產(chǎn)生. 40 ℃干燥，得到不同銀含量的硫脲殼聚糖-Ag配合物. 用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定Ag+質(zhì)量分?jǐn)?shù). 在硫脲殼聚糖-Ag配合物中的Ag+含量分別為0.18 mg/g、0.82 mg/g、1.44 mg/g和2.32 mg/g.

1.3.3 硫脲殼聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)對(duì)細(xì)菌的抑菌性能

將大腸桿菌和金黃葡萄球菌用營(yíng)養(yǎng)瓊脂試管斜面(15 g瓊脂，10 g蛋白胨，3 g牛肉膏，3 g食鹽溶于1 L水中)進(jìn)行活化后，取一環(huán)于生理鹽水中充分震蕩制成菌懸液，通過(guò)平板計(jì)數(shù)法[12]，確定菌懸液的稀釋度，使菌懸液所含活菌量為1×105～1×106CFU / mL.

用體積分?jǐn)?shù)為1% HAc溶液配制質(zhì)量濃度為5 g/L的TUCTS-Ag-1、TUCTS-Ag-2、TUCTS-Ag-3、TUCTS-Ag-4、TU-CTS和CTS 溶液，對(duì)照組為體積分?jǐn)?shù)1%的HAc溶液. 取直徑6 mm已滅菌的圓濾紙片充分浸泡在溶液中1 h. 取0.1 mL菌懸液均勻涂布在培養(yǎng)基平板上，然后用無(wú)菌鑷子夾取浸泡過(guò)樣品的圓濾紙片貼于培養(yǎng)皿中，每皿貼1片. 平行測(cè)定5組. 37 ℃恒溫培養(yǎng)24～48 h，測(cè)定抑菌圈直徑.

1.3.4 菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定硫脲殼聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)對(duì)真菌的抑菌性能

將真菌接種于馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)，27 ℃下活化長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，在菌落邊緣菌絲生長(zhǎng)旺盛處用打孔器打取直徑為0.5 cm的菌餅，備用. 將一定濃度不同的樣品與PDA混合，使樣品的最終濃度分別為0.5、0.25、0.1和0.05 g/L，以相應(yīng)濃度的HAc溶液作為空白對(duì)照，121 ℃高壓滅菌15 min后倒平板，冷卻后分別接種于每個(gè)培養(yǎng)皿中央( 有菌絲的一面向下). 每個(gè)培養(yǎng)皿放一個(gè)菌餅，每個(gè)處理設(shè) 5個(gè)重復(fù)，27 ℃ 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一定時(shí)間后，采用十字交叉法測(cè)定菌落直徑. 按以下公式計(jì)算抑菌率：

×100%

1.3.5 結(jié)構(gòu)表征

采用KBr 壓片法，掃描波數(shù)范圍為400～4 000 cm-1，測(cè)定殼聚糖、硫脲殼聚糖及硫脲殼聚糖-Ag配合物的紅外光譜；原子吸收分光光度計(jì)，火焰法，Ag燈測(cè)定.

2 結(jié)果與討論

2.1 硫脲殼聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)的紅外表征

由圖1可知，殼聚糖、硫脲殼聚糖及硫脲殼聚糖-Ag配合物的紅外吸收光譜大體上相似，三者的主要成分均為殼聚糖. 殼聚糖中位于3 446 cm-1左右的N-H、O-H締合峰形，改性后發(fā)生位移且峰形變窄；殼聚糖原位于1 664cm-1處較強(qiáng)的酰胺吸收峰和1 600cm-1左右的-NH2面內(nèi)彎曲振動(dòng)吸收峰，在硫脲殼聚糖中分別位移至1 638和1 616 cm-1處；硫脲殼聚糖在1 493 cm-1處出現(xiàn)一弱的新峰，表明在殼聚糖結(jié)構(gòu)中的-NH2上引入硫脲基團(tuán)[13]. 與TU-CTS相比，TUCTS-Ag配合物的紅外光譜在613、825.4 cm-1出現(xiàn)新的吸收峰[14]，歸屬為S-Ag伸縮振動(dòng)峰.

2.2 抑菌活性

圖1 殼聚糖(a)、硫脲殼聚糖(b)和硫脲殼聚糖-Ag配合物(c)的紅外光譜Fig.1 IR spectra of (a)CTS,(b)TU-CTS and (c)TUCTS-Ag

2.2.1 硫脲殼聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)對(duì)細(xì)菌的抑菌活性

如表1所示，殼聚糖，硫脲殼聚糖，硫脲殼聚糖-Ag配合物對(duì)大腸桿菌和金黃葡萄球菌的抑菌圈直徑均大于7 mm，說(shuō)明有抑菌效果. 硫脲殼聚糖的抑菌圈直徑比殼聚糖的小，可能是硫脲殼聚糖中自由氨基減少，能夠形成的陽(yáng)離子減少，抑菌效果降低. 4種硫脲殼聚糖-Ag配合物的抑菌圈直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于殼聚糖和硫脲殼聚糖的抑菌圈直徑，說(shuō)明硫脲殼聚糖-Ag配合物的抑菌效果很好. TUCTS-Ag-1、TUCTS-Ag-2、TUCTS-Ag-3和TUCTS-Ag-4因不同配合物中銀含量的不同，其抑菌效果不同；隨著TUCTS-Ag中銀含量的增大，抑菌效果明顯增強(qiáng). 這說(shuō)明配合物中銀的存在對(duì)抑菌有明顯的作用，還有殼聚糖中游離氨基形成的陽(yáng)離子正電荷起到協(xié)同作用.

2.2.2 硫脲殼聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)對(duì)真菌的抑菌作用

通過(guò)菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定不同樣品對(duì)不同真菌的抑菌性能，計(jì)算抑菌率，結(jié)果如表2和表3所示.

由表2可以看出，殼聚糖、硫脲殼聚糖和硫脲殼聚糖-Ag配合物對(duì)所測(cè)5種植物病原菌均有效果，除了殼聚糖對(duì)番茄灰霉菌無(wú)抑制. 硫脲殼聚糖相對(duì)殼聚糖，抑菌率明顯提高，說(shuō)明在殼聚糖分子結(jié)構(gòu)中引入的硫脲基團(tuán)有一定的抑菌性能. 與殼聚糖和硫脲殼聚糖的抑菌效果相比，硫脲殼聚糖-Ag配合物對(duì)病原菌的抑菌效果更好，由此說(shuō)明 Ag+已成功配位到硫脲殼聚糖結(jié)構(gòu)中，且由于銀本身具有很強(qiáng)的殺菌抑菌性能，加入極少量的Ag+(0.09 mg/L)，對(duì)蘋果腐爛菌和葡萄白腐菌的抑菌率高達(dá)82.54%和84.13%.

樣品濃度的不同對(duì)抑菌率的影響是非常顯著的，如表3所示. 不同的樣品因濃度的改變，抑菌率的變化規(guī)律基本一致. 對(duì)葡萄白腐菌，4個(gè)樣品的不同濃度溶液的抑菌率均超過(guò)70%，說(shuō)明硫脲殼聚糖-Ag配合物對(duì)葡萄白腐菌的抑制效果最好. 相比而言，對(duì)番茄灰霉菌，低濃度硫脲殼聚糖-Ag配合物的抑菌率小于10%，抑制菌絲的生長(zhǎng)效果比較差. 由此可以得出，同一樣品相同濃度對(duì)不同病原菌菌絲的生長(zhǎng)的抑制作用的關(guān)系為葡萄白腐菌>蘋果腐爛菌>蘋果輪紋菌>蘋果斑點(diǎn)落葉菌>番茄灰霉菌.

3 結(jié)論

本研究合成的不同銀含量的硫脲殼聚糖-Ag配合物(TUCTS-Ag)對(duì)細(xì)菌的抑菌效果均很好，與日常生活中常用的防腐保鮮劑二乙酸鈉和苯甲酸鈉相比，抑菌濃度分別是硫脲殼聚糖-Ag配合物的100倍和200倍[11]. 對(duì)5種病原菌，除了番茄灰霉菌，4個(gè)樣品硫脲殼聚糖-Ag配合物均有較強(qiáng)抑制作用. 不同濃度的不同樣品對(duì)葡萄白腐菌的抑菌率均大于70%；同一樣品相同濃度對(duì)不同病原菌菌絲的生長(zhǎng)的抑制作用的關(guān)系為葡萄白腐菌>蘋果腐爛菌>蘋果輪紋菌>蘋果斑點(diǎn)落葉菌>番茄灰霉菌. 另外，抑菌性能測(cè)試效果還與測(cè)試方法本身及系統(tǒng)中的指示菌濃度有關(guān)，合成的樣品的抑菌效果在不同實(shí)驗(yàn)中顯示出抑菌性能的差異，但同樣顯示出了硫脲殼聚糖-Ag配合物的抑菌性能較合成前的殼聚糖有顯著的增強(qiáng).

表2 不同樣品對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率Table 2 The inhibitory rate of different samples on pathogenic fungi

表3 不同濃度對(duì)病菌菌絲生長(zhǎng)的抑菌率Table 3 The inhibitory rate of different concentrations on pathogenic fungi

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