染料木素分子印跡聚合物的制備及其識(shí)別性能研究

郭秀春，李歡歡，周文輝*

(1.河南大學(xué) 藥學(xué)院，河南 開(kāi)封 475004； 2.河南大學(xué) 特種功能材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 開(kāi)封 475004)

分子印跡技術(shù)(MIT)是從仿生角度，采用人工方法制備對(duì)特定分子(模板)具有專一性結(jié)合的高分子技術(shù). 這種高分子材料被稱為分子印跡聚合物(MIPs). 通過(guò)對(duì)模板分子的分子印跡之后，在高分子基質(zhì)中就形成了在三維空間大小、形狀以及功能配基都與模板分子互補(bǔ)的分子印跡微腔，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)模板分子的特異性識(shí)別，這種特異性甚至可以和單克隆抗體相媲美. 自從1972 年德國(guó)的WULFF課題組首次提出了分子印跡聚合物的概念[1-2]，1993年MOSBACH等在Nature上發(fā)表分子印跡及其仿生免疫分析應(yīng)用的文章后，這一技術(shù)更為迅猛地發(fā)展起來(lái)[3]. 由于MIPs具有很好的選擇性，同時(shí)具有高度穩(wěn)定性和使用壽命長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，分子印跡技術(shù)已在化學(xué)仿生傳感器、抗體模擬酶、人工酶催化劑、色譜固定相、藥物手性分離、藥物控制釋放等諸多領(lǐng)域，顯示出誘人的應(yīng)用前景，已成為目前國(guó)際研究熱點(diǎn)課題[4-6]. BJARNASON等[7]首次報(bào)道了MIPs材料用于SPE，研究結(jié)果表明以MIPs作為固相萃取材料進(jìn)行固相萃取，選擇性較高且?guī)缀醪淮嬖陔s質(zhì)干擾. 從此，分子印跡固相萃取成為固相萃取研究的熱點(diǎn)之一，也成為分子印跡技術(shù)顯示其優(yōu)越性的重要應(yīng)用領(lǐng)域之一[8].

染料木素，又名金雀異黃酮，屬異黃酮類化合物. 染料木素主要存在于豆科植物中，例如大豆、槐角等. 染料木素具有明顯的抗腫瘤、抗氧化、降血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、雌激素功效、防治骨質(zhì)疏松等眾多的藥理作用[9-12]. 目前，染料木素應(yīng)用的劑型包括有栓劑、洗劑、注射液、片劑、膠囊等. 作者以染料木素為目標(biāo)產(chǎn)物和模板分子，采用本體聚合法制備了染料木素的分子印跡聚合物，該印跡聚合物對(duì)染料木素具有特異的吸附性能. 本文作者以該印跡聚合物為吸附劑自制分子印跡聚合物固相萃取小柱并將其用于豆奶粉中染料木素的高效提取，成功地從市售豆奶粉中檢測(cè)到了染料木素的存在.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

染料木素購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，4-乙烯基吡啶(4-VP)、乙二醇二甲基雙丙烯酸酯(EGDMA)購(gòu)自Alfa公司，偶氮二異丁腈(AIBN)購(gòu)自北京化學(xué)試劑公司. THF、甲醇、乙酸、乙腈、丙酮為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水. 豆奶粉購(gòu)自當(dāng)?shù)爻? DZF-6020型真空干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)、TGL-16G型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、TH-300A梯度混合器(上海滬西分析儀器廠)、QL-861漩渦振蕩器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、UV-2102 PCS型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯儀器有限公司).

1.2 分子印跡聚合物的制備

染料木素分子印跡聚合物(以下簡(jiǎn)稱“印跡聚合物”)的制備采用傳統(tǒng)的本體聚合法. 制備過(guò)程如下：染料木素1 mmol(約270 mg)、4-乙烯基吡啶4 mmol(約430 μL)、乙二醇二甲基雙丙烯酸酯20 mmol(約3.760 mL)、偶氮二異丁腈0.25 mmol(約40 mg)分散于10 mL THF中. 超聲分散10 min，氮吹除氧10 min之后密封反應(yīng)器，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下油浴60 ℃反應(yīng)24 h. 得到的塊狀聚合物經(jīng)研缽研磨，過(guò)200～400目篩，得到粒徑35～75 μm的聚合物顆粒. 用含10% (體積分?jǐn)?shù))乙酸的甲醇溶液置索氏提取器中提取48 h，除去模板分子及未反應(yīng)的單體化合物. 然后用乙腈洗滌除去殘留的乙酸和甲醇，聚合物顆粒經(jīng)丙酮反復(fù)沉降，除去細(xì)顆粒后，60 ℃真空干燥至恒重，即為染料木素的印跡聚合物.

空白聚合物制備方法除不加染料木素之外，其他制備和洗滌步驟與染料木素的印跡聚合物制備方法完全相同.

1.3 分子印跡聚合物的識(shí)別性能

取20 mg上述分子印跡聚合物(或空白聚合物)加入5 mL濃度在0.5～50 μmol/L范圍內(nèi)的染料木素甲醇溶液中. 室溫振蕩反應(yīng)5 h后高速離心，取上清液，并用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在260 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)上清液中染料木素的含量(標(biāo)準(zhǔn)曲線法)，最后根據(jù)溶液的濃度變化計(jì)算印跡聚合物(或空白聚合物)對(duì)染料木素的吸附量.

1.4 豆奶粉中染料木素的固相萃取

1.4.1 分子印跡固相萃取柱的灌裝與活化

取徹底清洗干凈的1 mL玻璃注射器為分子印跡固相萃取柱的柱體. 固相萃取柱灌裝前，玻璃注射器底端用脫脂棉作為篩板，防止印跡聚合物顆粒的流失. 取100 mg印跡聚合物，以乙腈為勻漿液，進(jìn)行濕法裝柱. 待印跡聚合物穩(wěn)定之后，氮?dú)獯蹈晒滔噍腿≈频萌玖夏舅胤肿佑≯E聚合物固相萃取小柱(以下簡(jiǎn)稱“固相萃取小柱”). 固相萃取小柱使用前依次用2 mL水、2 mL甲醇活化，氮?dú)獯蹈蓚溆?

1.4.2 豆奶粉提取液的制備

準(zhǔn)確稱取1 g豆奶粉，加入甲醇5 mL，漩渦振蕩1 min之后超聲提取30 min. 提取之后，樣品在10 000 r/min轉(zhuǎn)速條件下離心5 min，過(guò)濾所得上清液即為豆奶粉提取液.

1.4.3 豆奶粉提取液中染料木素的固相萃取

將豆奶粉提取液加至固相萃取小柱，以0.25 mL/min的速度過(guò)固相萃取小柱，并用氮?dú)獯蹈晒滔噍腿⌒≈? 之后依次用2 mL水和2 mL甲醇淋洗固相萃取小柱，流速為0.25 mL/min，并用氮?dú)獯蹈晒滔噍腿⌒≈? 最后用3 mL含5 %濃醋酸的甲醇洗脫，流速為0.25 mL/min，收集洗脫液. 洗脫液氮吹濃縮至干，用甲醇定容至1 mL進(jìn)行HPLC檢測(cè).

圖1 染料木素的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of genistein

2 結(jié)果與討論

2.1 印跡聚合物的制備

染料木素屬于黃酮類物質(zhì)，學(xué)名為 5,7,4′-三羥基異黃酮. 染料木素分子結(jié)構(gòu)中具有三個(gè)酚羥基(分子結(jié)構(gòu)如圖 1)，整個(gè)分子成弱酸性并且極性較大，不溶于甲苯、氯仿、乙腈等分子印跡聚合物制備常用的溶劑中，在THF中的溶解度能夠滿足分子印跡聚合物制備的要求，因此實(shí)驗(yàn)中采用THF為溶劑和致孔劑. 由于染料木素分子結(jié)構(gòu)中的酚羥基能夠較好地與功能單體4-乙烯基吡啶分子結(jié)構(gòu)中的吡啶基形成分子間氫鍵，因此實(shí)驗(yàn)中選擇4-乙烯基吡啶為功能單體. 交聯(lián)劑為乙二醇二甲基雙丙烯酸酯，引發(fā)劑為偶氮二異丁腈，采用最為常用熱引發(fā)本體聚合技術(shù)制備染料木素的分子印跡聚合物.

2.2 印跡聚合物的識(shí)別性能

采用靜態(tài)平衡法，測(cè)定了印跡聚合物對(duì)不同濃度染料木素的等溫吸附曲線. 印跡聚合物對(duì)染料木素的吸附量采用公式Qn= (C0-Cn) ×V/m計(jì)算, 其中C0表示染料木素的初始濃度,Cn表示吸附平衡時(shí)染料木素的濃度，V為染料木素溶液的體積，m為印跡聚合物的質(zhì)量，Qn表示單位質(zhì)量印跡聚合物對(duì)不同濃度樣品的吸附量. 其結(jié)果如圖2所示, 可以看出印跡聚合物對(duì)染料木素的吸附容量隨體系中染料木素的初始濃度的增加而增加. 在相同初始染料木素濃度條件下，印跡聚合物對(duì)染料木素分子的吸附容量明顯高于非印跡聚合物的吸附容量，這表明印跡聚合物具有對(duì)染料木素分子的特異性分子識(shí)別能力.

2.3 印跡聚合物的選擇性識(shí)別

為了研究印跡聚合物的選擇吸附性, 實(shí)驗(yàn)中選擇了和染料木素具有相似結(jié)構(gòu)兩種異黃酮類化合物：黃豆苷元和槲皮素進(jìn)行比較. 通過(guò)靜態(tài)平衡法測(cè)定印跡聚合物對(duì)不同異黃酮的吸附性能, 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示. 可以看出以染料木素為模板分子制備的印跡聚合物對(duì)染料木素的吸附量要大于對(duì)其結(jié)構(gòu)類似物的吸附量，而非分子印跡聚合物對(duì)染料木素和結(jié)構(gòu)類似物的吸附大致相同，該結(jié)果表明所合成的分子印跡聚合物對(duì)染料木素具有一定的選擇性吸附能力. 而非印跡聚合物對(duì)染料木素和結(jié)構(gòu)類似物的吸附主要是非特異性的物理吸附，因此其吸附能力較弱.

圖2 印跡(非印跡)聚合物對(duì)染料木素的吸附研究Fig.2 Amount of bound genistein by MIP (■) and NIP (●)

圖3 印跡(非印跡)聚合物對(duì)染料木素及其結(jié)構(gòu)類似物的選擇性吸附Fig.3 Binding behavior of genistein and analogue on the MIP (or NIP)

2.4 利用固相萃取小柱結(jié)合HPLC測(cè)定豆奶粉中染料木素的含量

利用自制固相萃取小柱，按照1.4 所述豆奶粉中染料木素固相萃取方法，利用外標(biāo)法測(cè)定了從當(dāng)?shù)爻匈?gòu)得的四種不同品牌豆奶粉中染料木素的含量，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 不同品種豆奶粉中染料木素的含量Table 1 Contents of genistein in different soybean milk powder

3 結(jié)論

本文以4-乙烯基吡啶為功能單體, 乙二醇二甲基雙丙烯酸酯為交聯(lián)劑, 偶氮二異丁腈為引發(fā)劑, 在THF中采用本體聚合法制備了對(duì)染料木素有特異識(shí)別性能的分子印跡聚合物. 以該印跡聚合物為吸附劑制備了對(duì)染料木素具有特異吸附能力的分子印跡固相萃取小柱，結(jié)合HPLC對(duì)豆奶粉中的染料木素進(jìn)行了測(cè)定，豆奶粉中染料木素含量3.93～7.08 μg/g. 該印跡聚合物和固相萃取小柱有望在染料木素的高效提取和豆制品中染料木素的分析檢測(cè)中得到應(yīng)用.

參考文獻(xiàn)：

[1] WULFF G, SARHAN A. The use of polymers with enzyme-analogous structures for the resolution of racemates[J]. Angew Chem Int Ed, 1972, 11(4): 341-344.

[2] WULFF G, SARHAN A. über die anwendung von enzymanalog gebauten polymeren zur racemattrennung[J]. Angew Chem, 1972, 84(8): 364-364.

[3] VLATAKIS G, ANDERSSON L I, MULLER R, et al. Drug assay using antibody mimics made by molecular imprinting[J]. Nature, 1993, 361(6413): 645-647.

[4] 賴家平, 何錫文, 郭洪聲, 等. 分子印跡技術(shù)的回顧、現(xiàn)狀與展望[J]. 分析化學(xué), 2001, 29(7): 836-844.

[5] TAKEUCHI T, HAGINAKA J. Separation and sensing based on molecular recognition using molecularly imprinted polymers[J]. J Chromatogr B: Biomed Sci Appl, 1999, 728(1): 1-20.

[6] HAUPT K, MOSBACH K. Molecularly imprinted polymers and their use in biomimetic sensors[J]. Chem Rev, 2000, 100(7): 2495-2504.

[7] SELLERGREN B. Direct Drug determination by selective sample enrichment on an imprinted polymer[J]. Anal Chem, 1994, 66(9): 1578-1582.

[8] 董襄朝. 分子印跡聚合物在復(fù)雜體系分離中的應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 分析測(cè)試學(xué)報(bào), 2004, 23(6): 119-123.

[9] CONSTANTINOU A L, KRYGIER A E, MEHTA R R. Genistein induces maturation of cultured human breast cancer cells and prevents tumor growth in nude mice[J]. Am J Clin Nutr, 1998, 68(6): 1426S-1430S.

[10] ADLERCREUTZ H, MAZUR W. Phyto-estrogens and Western diseases[J]. Ann Med, 1997, 29(2): 95-120.

[11] MESSINA M, PERSKY V, SETCHELL K D R, et al. Soy intake and cancer risk: A review of the in vitro and in vivo data[J]. Nutr Cancer, 1994, 21(2): 113-131.

[12] MESSINA M. Modern applications for an ancient bean: soybeans and the prevention and treatment of chronic disease[J]. J Nutr, 1995, 125(3): 567S-569S.