金絲草總黃酮的提取與抗氧化性研究

林燕如，陳宜菲，李粉玲

（韓山師范學(xué)院化學(xué)系，廣東潮州 521041）

金絲草為禾本科金發(fā)草屬植物金絲草（Pogonatherumcrinitum（Thunb.）Kunth）的全草，別名落蘇、墻頭竹、猴毛草、貓毛草等，分布廣，資源豐富.金絲草性寒、無毒，具有清熱、解暑、利尿之功效.金絲草中主要活性成分是黃酮[1]，但金絲草總黃酮的提取工藝及其抗氧化性的研究尚未見報(bào)道，為此本文采用正交試驗(yàn)分析法對(duì)超聲波輔助提取金絲草中總黃酮的工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，并采用水楊酸法測(cè)定其清除羥自由基能力、鄰苯三酚自氧化法測(cè)定其清除超氧自由基能力和普魯士藍(lán)法測(cè)定其還原能力，為金絲草的開發(fā)利用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

金絲草購(gòu)自潮州南橋市場(chǎng)，置于60℃烘箱內(nèi)干燥24 h，充分干燥后粉碎，過40目篩備用.

蘆丁對(duì)照品（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）、95%乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、硫酸亞鐵、過氧化氫、水楊酸、鐵氰化鉀、三氯乙酸、三氯化鐵、抗壞血酸、鄰苯三酚、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀均為分析純.

KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），Spectrumlab 752S紫外可見分光光度計(jì)（上海棱光技術(shù)有限公司）.

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

依據(jù)文獻(xiàn)[2]的方法，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，蘆丁質(zhì)量濃度（C）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得蘆丁標(biāo)液質(zhì)量濃度（C）與吸光度值（A）關(guān)系曲線的線性回歸方程式為：A=9.031 8C-0.004，R2=0.998 9.

1.2.2 金絲草中黃酮含量的測(cè)定

依據(jù)文獻(xiàn)[2-3]的方法，取金絲草1 g，置于50 mL錐形瓶中，按一定的料液比加入乙醇溶液；采用超聲功率70 W，分別在不同乙醇濃度、料液比、超聲溫度和時(shí)間等條件下進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，趁熱抽濾，濾液定容至100 mL，為金絲草總黃酮提取液.以3 000 r/min，離心10 min后，取1 mL提取液置于10 mL比色管中，于波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)定吸光度值，再根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算黃酮含量.在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化金絲草總黃酮的超聲波輔助提取工藝參數(shù).

1.2.3 回收率試驗(yàn)

采用樣品加標(biāo)回收率試驗(yàn)法[4-5].取4份金絲草總黃酮提取液各1 mL，其中3份加0.4 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，于波長(zhǎng)為510 nm處測(cè)定吸光值，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次，計(jì)算回收率.回收率（%）=（V1C1-V2C2）/V0C0×100%，式中：V0：加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的體積（mL）；C0：蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度（mg/mL）；V1：加蘆丁的樣品溶液的體積（mL）；C1：加蘆丁的樣品溶液的濃度（mg/mL）；V2：未加蘆丁的樣品溶液體積（mL）；C2：未加蘆丁的樣品溶液濃度（mg/mL）.

1.2.4 金絲草總黃酮的抗氧化試驗(yàn)

（1）金絲草總黃酮對(duì)羥自由基（·OH）的清除[6-7].在5支10 mL比色管中依次加入2 mmol/L的FeSO4溶液2.5 mL和2 mmol/L的H2O2溶液2.5 mL，混合后加入6 mmol/L水楊酸溶液2.5 mL，搖勻.37℃水浴15 min，在510 nm處測(cè)其吸光度值為A0（蒸餾水為參比液）.加入0.0143 mg/mL的金絲草黃酮提取物液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，用蒸餾水定容至10 mL，搖勻，在37℃下水浴15 min，在510 nm處測(cè)其吸光度值為Ax（蒸餾水為參比液）.對(duì)羥自由基清除率的計(jì)算公式為：·OH清除率（%）=（A0-Ax）/A0×100%.

（2）金絲草總黃酮對(duì)超氧自由基（O2-·）的清除[6-7].在室溫下，往6支比色管中加入66.7 mmol/L的PBS（pH 8.34）緩沖液5.0 mL；再加入0.014 3 mg/mL的金絲草黃酮提取物各0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL（不加樣品液為空白對(duì)照），最后加入2 mmol/L的鄰苯三酚1 mL，取一定量緩沖溶液使體系總體積達(dá)到9 mL，立即混勻；以蒸餾水作空白參照，在322 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)322，每隔30 s測(cè)1次至反應(yīng)啟動(dòng)后的第4 min，把所得的數(shù)據(jù)以時(shí)間為橫坐標(biāo)，A322值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到直線斜率為反應(yīng)速率V自、V樣.清除率按下式計(jì)算：O2-·清除率（%）=（V自-V樣）/V自×100%（V自：不加待測(cè)液的反應(yīng)速率；V樣：加入待測(cè)液的反應(yīng)速率.）

（3）金絲草總黃酮的還原能力測(cè)定[8-9].在6支25 mL比色管中各加入pH 6.6的磷酸鹽緩沖溶液2.5 mL，再依次加入濃度為0.014 3、0.028 6、0.042 9、0.057 2、0.071 5 mg/mL的總黃酮提取液2.5 mL，加入1%的鐵氰化鉀溶液2.5 mL，混合物在50℃恒溫20 min后，快速冷卻，再加入10%的三氯乙酸溶液2.5 mL，然后以3 000 r/min離心10 min，靜置片刻后，取上層清液5 mL加蒸餾水5 mL和0.1%的三氯化鐵溶液1 mL，搖勻，靜置15 min，待溶液從黃色變?yōu)樗{(lán)色，在700 nm處測(cè)定其吸光度A.用2.5 mL的蒸餾水代替樣品液做空白.

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乙醇濃度對(duì)提取率的影響

由圖1A可知，乙醇濃度不同，其它條件相同（超聲時(shí)間30 min，超聲功率70 W，超聲溫度30℃，料液比1∶25），總黃酮提取率開始隨乙醇濃度的增大而增加.當(dāng)濃度達(dá)到50%時(shí)，總黃酮提取率最高；但當(dāng)乙醇濃度再增大時(shí)，雜質(zhì)的溶出量增加，提取率反而開始下降，這給后續(xù)的處理帶來了很大的不便.故將乙醇濃度定為40%～60%左右較好.

2.1.2 料液比對(duì)提取率的影響

由圖1B可以看出，料液比不同，其它條件相同（超聲時(shí)間30 min，超聲功率70 W，超聲溫度30℃，乙醇濃度50%），提取率在料液比為1∶10～1∶30時(shí)，隨著料液比增大提取率較快地增大，但當(dāng)料液比大于1∶30后，提取率反而下降.因此，當(dāng)料液比為1∶30時(shí)，就可以達(dá)到最佳的提取效果.在實(shí)際操作中，當(dāng)浸提的料液比過小時(shí)，提取液偏少，不利于過濾分離；當(dāng)浸提的料液比過大時(shí)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)轉(zhuǎn)移溶劑時(shí)耗時(shí)長(zhǎng)、耗能多.同時(shí)，料液比過大不但會(huì)增加溶劑的用量，而且會(huì)增大去除溶劑所需負(fù)荷，故料液比定在1∶25～1∶35之間較合適.

2.1.3 超聲溫度對(duì)提取率的影響

如圖1C所示，超聲溫度不同，其它條件相同（超聲時(shí)間30 min，超聲功率70 W，料液比1∶30，乙醇濃度50%），隨超聲提取時(shí)溫度的升高，提取率不斷提高；當(dāng)溫度為42℃時(shí)，提取率達(dá)到4.63%；繼續(xù)升高溫度，提取率增加緩慢；同時(shí)溫度過高時(shí)，一方面其中的活性成分會(huì)被破壞，雜質(zhì)的溶出量增加，給后續(xù)的處理帶來很大的不便，增加生產(chǎn)的成本；另一方面也會(huì)造成溶劑的損失.綜合考慮，超聲溫度應(yīng)為37～47℃.

2.1.4 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取效果的影響

如圖1D所示，超聲時(shí)間不同，其它條件相同（超聲溫度42℃，超聲功率70 W，料液比1∶30，乙醇濃度50%），超聲時(shí)間為30 min左右效果較佳，此后提取液內(nèi)的有效成分含量下降，原因可能是在長(zhǎng)時(shí)間超聲作用下，提取率逐漸向極限值靠近，致使提取率增幅降低；同時(shí)超聲作用時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)使提取粗品中雜質(zhì)含量增加，有效成分含量反而降低，影響提取物有效含量.考慮到盡量節(jié)約時(shí)間的關(guān)系，將超聲時(shí)間定在25～35 min.

圖1 不同提取條件下金絲草總黃酮的提取率

2.2 正交試驗(yàn)

選用乙醇濃度、超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比等四個(gè)主要因素進(jìn)行正交試驗(yàn)，以全面研究這四個(gè)因素的交叉作用對(duì)金絲草總黃酮提取率的影響.選用L9（34）正交試驗(yàn)表進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以金絲草總黃酮提取率為試驗(yàn)指標(biāo).試驗(yàn)結(jié)果及極差分析見表1.

從表1與表2可知，各實(shí)驗(yàn)因素及其因素水平對(duì)金絲草中總黃酮的提取率大小的影響表現(xiàn)出一定的差異性.影響金絲草總黃酮提取率的因素主次順序?yàn)锳＞B＞C＞D，即乙醇濃度影響最大，其次是超聲溫度和超聲時(shí)間，料液比影響最小.綜合以上因素得到金絲草中總黃酮提取的最佳工藝條件為A2B3C3D3，即乙醇濃度為50%，超聲溫度為47℃，超聲波功率為70 W，超聲時(shí)間35 min，料液比1∶35.在最佳工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果金絲草總黃酮提取率達(dá)3.08%，高于正交試驗(yàn)5的黃酮提取率3.020%.

表 1 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 回收率

由表3可知，提取液中的黃酮類化合物含量的加樣回收率偏高，在106.750%-112%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.580%，因此該方法準(zhǔn)確度較高.

表 3 金絲草總黃酮的回收率

2.4 金絲草總黃酮的抗氧化作用

2.4.1 不同添加量的金絲草總黃酮對(duì)羥自由基和超氧自由基的清除效果

由圖2可知，在添加量為0.003～0.014 mg范圍內(nèi)，隨著金絲草總黃酮添加量的增加，清除羥自由基和超氧自由基的效果均出現(xiàn)逐漸增強(qiáng).當(dāng)添加量為0.014 mg時(shí)，其對(duì)羥自由基和超氧自由基的清除率分別達(dá)到了57.380%和15.460%，表明金絲草總黃酮對(duì)羥自由基和超氧自由基有較好的清除效果.在添加量為0.011～0.014 mg范圍內(nèi)時(shí)，金絲草總黃酮對(duì)羥自由基和超氧自由基的清除率隨著添加量的增加而趨于穩(wěn)定.

2.4.2 金絲草總黃酮的還原能力

由圖3可看出，金絲草總黃酮提取液具有較好的還原能力，是良好的電子供應(yīng)者，其供應(yīng)的電子除可以使Fe3+還原成Fe2+外，還可與自由基成為較惰性的物質(zhì)，以阻斷自氧化鏈鎖反應(yīng).在添加量為0.036～0.179 mg范圍內(nèi)，樣品的還原能力隨著濃度的增加而增強(qiáng).提示金絲草總黃酮提取液的抗氧化能力隨濃度的增加而增加.

圖2 金絲草總黃酮對(duì)羥自由基和超氧自由基的清除

圖3 金絲草總黃酮的還原能力

3 結(jié)論

本研究在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)法優(yōu)化了金絲草總黃酮的超聲提取工藝，確定了金絲草總黃酮的最佳提取條件：乙醇濃度50%、料液比1∶35、超聲溫度47℃、超聲時(shí)間35 min、超聲功率70 W，在此條件下總黃酮的提取率為3.080%.

金絲草總黃酮含量較高，金絲草黃酮提取物對(duì)羥基自由基的清除效果較好，對(duì)超氧自由基有一定的清除作用，具有較好的還原能力.由此可見，金絲草具有較高的藥用價(jià)值.金絲草分布較廣，來源豐富，毒性低，價(jià)格低廉，值得在中成藥方面開發(fā)利用.

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