聚苯胺分子印跡膜電化學(xué)傳感器檢測氯霉素

李歡歡，常志顯,2，周文輝*

(1. 河南大學(xué) 特種功能材料教育部重點實驗室，河南 開封 475004； 2. 河南大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，河南 開封 475004)

氯霉素(chloramphenicol，CAP)是一種廣譜、高效的抗菌藥，其對革蘭氏陰性菌感染具有很好的控制作用，特別是對傷寒桿菌及其他沙門氏菌有特效. CAP具有很強的毒副作用，對人和動物會造成骨髓抑制、再生障礙性貧血、發(fā)育不全、血小板和白細胞減少等癥狀[1]. 因此建立方便、靈敏、準確的CAP測定方法具有非常重要的現(xiàn)實意義. 目前CAP的測定方法主要有液相色譜法[2-4]、氣相色譜法[5]、液相色譜-質(zhì)譜法[6-8]、電化學(xué)方法[9-10]等，其中電化學(xué)方法由于儀器簡單、操作方便并且靈敏度高而受到廣泛的重視.

分子印跡技術(shù)是近幾年發(fā)展起來的一種新型高效的分離技術(shù)，其以待分離的目標分子或者結(jié)構(gòu)類似物為模板分子，與功能單體結(jié)合后在引發(fā)劑和交聯(lián)劑的作用下共聚得到剛性聚合物，除去模板分子后在聚合物中形成與模板分子空間互補，并具有預(yù)定的多重作用位點的分子印跡聚合物. 分子印跡聚合物對模板分子的結(jié)構(gòu)具有“記憶”效應(yīng)，能夠高選擇性的識別復(fù)雜樣品中的印跡分子[11-12]. 電化學(xué)方法與分子印跡技術(shù)相結(jié)合可以方便構(gòu)建各種電化學(xué)傳感器用于復(fù)雜樣品中待測物的高靈敏度、高選擇性的檢測[13-16]. 作者采用循環(huán)伏安法在金電極上成功制得了氯霉素的聚苯胺分子印跡膜，所制備的聚苯胺分子印跡膜具有制備簡單、響應(yīng)快速、靈敏度高、再生性能良好的特點，結(jié)合差示脈沖法建立了氯霉素的檢測方法并成功用于氯霉素眼藥水中氯霉素的定量檢測.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

苯胺、鐵氰化鉀、氯化鉀、硫酸均為分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；氯霉素標準品購自Alfa公司；實驗用水為三次蒸餾水.

分子印跡膜的制備與氯霉素檢測均在LK2005B型電化學(xué)工作站上完成，電化學(xué)測試采用三電極體系：金電極為工作電極，鉑絲電極為輔助電極，Ag/AgCl為參比電極.

1.2 金電極的處理

將金電極用Al2O3納米粉進行拋光然后用蒸餾水沖洗，反復(fù)進行此操作直至電極表面明亮如鏡，然后將金電極置于0.5 mol·L-1的硫酸溶液中于1.0～-1.0 V下進行多次循環(huán)伏安掃描直至所掃描的循環(huán)伏安曲線基本重合，獲得穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應(yīng)圖. 然后將金電極置于超聲除氧后的鐵氰化鉀溶液中(內(nèi)含 0.2 mol·L-1KCl和1 mmol·L-1K3[Fe(CN)6])進行循環(huán)伏安掃描，直至出現(xiàn)穩(wěn)定的循環(huán)伏安響應(yīng)圖且氧化峰和還原峰的電位差小于80 mV，表明金電極已經(jīng)磨平且符合實驗需求，可以進行下一步的聚合. 鉑絲對電極、Ag/AgCl參比電極用三次蒸餾水沖洗干凈備用.

1.3 分子印跡膜的制備

取濃度為0.25 mol·L-1的硫酸溶液20 mL，向其中加入苯胺200 μL，再加入氯霉素標準品0.012 9 g，超聲混合均勻制得預(yù)聚合溶液備用. 將三電極置于上述所配置的預(yù)聚合溶液中，在電壓為0.9～-0.2 V的范圍內(nèi)進行循環(huán)伏安掃描25圈，掃描速度為100 mV/s，在金電極表面制備聚苯胺分子印跡膜. 聚苯胺分子印跡膜修飾電極制備完成后，用乙醇/氨水體積比為19∶1的混合溶液作為洗脫液對聚苯胺分子印跡膜進行模板分子的洗脫，以去除包埋在聚苯胺分子印跡膜內(nèi)的氯霉素. 洗脫過程采用浸泡1 h然后用三次蒸餾水沖洗的方式進行，重復(fù)操作三遍，以完全除去聚苯胺膜中的模板分子氯霉素. 對照組非分子印跡膜的制備除了不加入氯霉素標準品外，其他步驟與聚苯胺分子印跡膜的制備與洗脫方法相同.

2 結(jié)果與討論

2.1 聚苯胺分子印跡膜的電聚合制備

氯霉素分子結(jié)構(gòu)中含有兩個羥基，一個酰胺鍵和一個硝基，三者均有可能與胺基形成分子間氫鍵，得到分子印跡聚合物后可以起到識別模板分子氯霉素的作用(圖1). 因此，實驗中以苯胺為功能單體和交聯(lián)劑，采用電化學(xué)聚合的方法制備氯霉素的聚苯胺分子印跡膜.

圖1 氯霉素和苯胺的分子結(jié)構(gòu)式Fig.1 The structure formulas of CAP and aniline

圖2給出了苯胺在金電極上的電聚合過程的循環(huán)伏安曲線，可以看到，在循環(huán)伏安掃描初期，循環(huán)伏安的氧化峰和還原峰的峰電流比較小，說明電聚合的早期所形成的聚合物膜的導(dǎo)電能力較弱. 隨著循環(huán)伏安掃描圈數(shù)的持續(xù)增加(苯胺在金電極上的電聚合過程的進行)，循環(huán)伏安的氧化峰和還原峰的峰電流逐漸增大，說明逐漸有導(dǎo)電聚合物在金電極上形成(也即高導(dǎo)電能力的聚苯胺的形成). 掃描結(jié)束后，肉眼可見在金電極上形成了一層深綠色的聚苯胺薄膜.

圖2 苯胺在金電極上的電聚合過程Fig.2 The electro-polymerization process of aniline on gold electrode

2.2 氯霉素的氧化還原峰位的確定

為了了解CAP的電化學(xué)氧化還原特征，我們研究了0.02 g/L氯霉素標準溶液在裸金電極上的循環(huán)伏安特性(圖3). 從圖3可以看出，在循環(huán)伏安掃描過程中，CAP只有還原峰而沒有對應(yīng)的氧化峰，說明氯霉素的氧化還原反應(yīng)是一個完全不可逆的過程. 同時，可以看到CAP的還原峰是位于0.3～0.6 V之間的一個寬峰，也說明氯霉素的還原峰位大致在此附近.

2.3 氯霉素在不同電極表面的電化學(xué)響應(yīng)

為了證明聚苯胺分子印跡膜在金電極上的成功制備，我們研究了分子印跡修飾電極(MIP)、非印跡膜修飾電極(NIP)以及裸電極(Bare)在濃度為0.02 g/L的氯霉素標準溶液中的差示脈沖特性(圖4). 從圖4可以看到，分子印跡膜修飾電極對氯霉素的響應(yīng)峰電流最高，非印跡膜修飾電極對氯霉素的響應(yīng)峰電流次之，裸金電極對氯霉素的響應(yīng)峰電流最低. 這一實驗結(jié)果表明金電極上的聚苯胺分子印跡膜和非分子印跡膜對氯霉素都有一定的吸附和識別能力，體現(xiàn)為兩者均具有一定的差示脈沖峰電流. 裸電極的峰電流最小，說明裸電極對氯霉素的吸附能力最弱. 聚苯胺分子印跡膜比非分子印跡膜修飾電極的峰電流高，說明聚苯胺分子印跡膜除了具有與非分子印跡膜相同的非特異性吸附能力外，還有因為聚苯胺分子印跡膜內(nèi)部的孔穴及識別位點產(chǎn)生的特異性識別能力. 除了峰電流的差別外，我們還發(fā)現(xiàn)氯霉素在三種電極上差示脈沖曲線的峰位有少許的差別，這可能與氯霉素發(fā)生氧化還原反應(yīng)的場所或者界面性質(zhì)不同有關(guān). 同時這一結(jié)果也從側(cè)面證明了，聚苯胺非分子印跡膜對氯霉素具有非特異性識別能力，而聚苯胺分子印跡膜對氯霉素同時具有特異性識別能力和非特異性識別能力.

圖3 裸金電極在濃度為0.02 g/L氯霉素溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.3 The cyclic voltammograms of bare gold electrode in 0.02 g/L CAP solution

圖4 不同電極在濃度為0.02 g/L上的差示脈沖圖Fig.4 The differential pulse diagrams of different electrodes in 0.02 g/L CAP solution

2.4 吸附時間對聚苯胺分子印跡膜修飾電極性能的影響

模板分子在分子印跡膜上的吸附時間是影響印跡膜電化學(xué)響應(yīng)的主要因素. 為了選擇合適的吸附時間，我們對比了不同吸附時間下氯霉素在聚苯胺分子印跡膜修飾電極上的差示脈沖響應(yīng). 圖5給出了0.1 g/L的氯霉素標準溶液在聚苯胺分子印跡膜修飾電極上的差示脈沖峰電流隨吸附時間變化的曲線. 從圖5可以看到，隨著吸附時間的增大，峰電流逐漸增加，當吸附時間達到4 min之后峰電流趨于穩(wěn)定，說明氯霉素在聚苯胺分子印跡膜上的吸附達到飽和. 考慮到實驗的有效性，本實驗中模板分子的吸附時間均設(shè)定為5 min.

2.5 標準曲線

配制了一系列的氯霉素標準溶液，濃度分別為0.000 5，0.001，0.002，0.005，0.01，0.02和0.05 g/L. 將聚苯胺分子印跡膜修飾的電極分別置于一系列不同濃度的CAP溶液以及空白溶液中進行差示脈沖測定，以聚苯胺分子印跡膜修飾電極在標準溶液中的DPV峰電流與在空白溶液中的DPV峰電流差值為縱坐標，以CAP標準溶液的濃度為橫坐標進行作圖，其結(jié)果如圖6所示. 從圖6可以看出，氯霉素在分子印跡膜修飾電極上的吸附存在兩個明顯的線性區(qū)間范圍，其原因可能是不同濃度范圍內(nèi)，氯霉素在聚苯胺分子印跡膜上的吸附模式不同或者是在兩個濃度范圍內(nèi)的動力學(xué)模式不同(如擴散控制和吸附控制). 以CAP濃度范圍為0.002～0.05 g/L為例，其線性相關(guān)方程為:y= 3 165.4x+ 427.35，線性相關(guān)系數(shù)為0.992，滿足作為工作曲線的要求，可以用來測定未知濃度的氯霉素.

圖5 吸附時間對MIP修飾電極在濃度為0.02 g/L氯霉素溶液中峰電流響應(yīng)的影響Fig.5 The effect of adsorption time on peak current of MIP film modified gold electrode in 0.02 g/L CAP solution

圖6 聚苯胺分子印跡膜修飾電極測試氯霉素的標準曲線Fig.6 The calibration curve of CAP on MIP film modified gold electrode

2.6 分子印跡膜的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

研究了所建立方法的重現(xiàn)性與穩(wěn)定性，首先測試了0.02 g/L的氯霉素標準溶液在3個分別按照1.3中所述實驗方法制得的聚苯胺分子印跡膜修飾電極上的電化學(xué)響應(yīng)，所得結(jié)果的相對標準偏差(relative standard deviation，RSD)為2.7 %. 對于同一個聚苯胺分子印跡膜修飾電極，其在0.02 g/L的氯霉素標準溶液中連續(xù)7次測定的電流響應(yīng)值基本不變. 將該電極置于室溫條件下，放置15 d后進行測定，電化學(xué)響應(yīng)信號依然保留了初始的90 %. 以上結(jié)果證明本方法所制備的聚苯胺分子印跡膜具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性.

2.7 實際樣品分析

取市售濃度為2.5 g/L的氯霉素眼藥水0.2 mL，用三次蒸餾水稀釋并定容至25 mL，得到濃度為0.02 g/L的氯霉素樣品. 利用上述所建立的氯霉素分析方法進行測試，將測試結(jié)果扣除空白值后，代入線性方程y= 3 165.4x+ 427.35，計算實際樣品中的氯霉素含量，三次測試結(jié)果的平均值為0.021 g/L與樣品標示值0.02 g/L接近，結(jié)果令人滿意.

3 結(jié)論

利用電化學(xué)聚合的方法在金電極上制備了氯霉素的聚苯胺分子印跡膜，這種分子印跡膜制備方法簡單，耗時短，所得到的分子印跡膜均勻穩(wěn)定. 結(jié)合差示脈沖技術(shù)建立了對氯霉素的電化學(xué)傳感器檢測方法，該方法穩(wěn)定性和重現(xiàn)性良好，用于氯霉素眼藥水樣品的檢測獲得了令人滿意的結(jié)果，該方法適用于實際樣品中氯霉素的檢測.

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