白花丹素鑭(Ⅲ)配合物與牛血清白蛋白相互作用的光譜學(xué)研究

顧運瓊，梁偉江，羅旭健，周 能，譚明雄,2*

(1. 玉林師范學(xué)院 化學(xué)與材料學(xué)院，廣西 玉林 537000; 2. 廣西師范大學(xué) 藥用資源化學(xué)與藥物分子工程教育部重點實驗室，廣西 桂林 541004)

在中藥學(xué)、藥理學(xué)和生物化學(xué)領(lǐng)域，藥物與血漿蛋白相互作用是一個熱點研究領(lǐng)域[1-2]. 血清白蛋白(SA)是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，它是一種多功能的蛋白質(zhì). 作為許多內(nèi)源性和外源性物質(zhì)(包括脂肪酸，氨基酸，金屬離子以及許多通過氫鍵、疏水性、靜電作用和金屬離子相互作用的藥物[3])的運輸和處置的載體. 牛血清白蛋白(BSA) 經(jīng)常作為模型蛋白用于研究藥物與肌體結(jié)合的機(jī)制[4].

很早就有研究表明，牛血清白蛋白BSA與抗腫瘤藥物的相互作用可能會降低藥物的有效濃度，從而影響其在化療過程中的生物利用度和毒性[5]. 由此可以推斷，BSA與藥物之間的相互作用會影響其分布、藥理特性和在血液中的藥物代謝. 此外，金屬離子可以影響藥物分子與牛血清白蛋白在藥物-蛋白質(zhì)-金屬離子或金屬-藥物-蛋白質(zhì)的三元體系中的相互作用[6]. 據(jù)報道，牛血清白蛋白與各種金屬，包括過渡金屬和稀土金屬離子形成共價加合物[7]. 在這種情況下，金屬離子這個位點通過與來自NH2基團(tuán)中的氮原子的相互作用，類似于組氨酸中的咪唑基團(tuán)和不同的肽殘基的氮原子的相互作用[8]. 除了血漿中的某些金屬離子外，許多外源性金屬離子都可以與藥物分子(如天然存在的色酮類、黃酮類、香豆素類化合物)形成配合物，從而影響藥物的某些性質(zhì)[9].

我們已經(jīng)報道過白花丹素(PLN)及其鑭(Ⅲ)配合物L(fēng)a (C11H7O3)3(H2O)2(PLN-La(Ⅲ)，圖1)的合成及其抗腫瘤活性[10]. PLN是從傳統(tǒng)中藥白花丹中提取出來的萘醌類化合物(2-甲基-5-羥基-1，4萘醌). 研究發(fā)現(xiàn)，PLN及其PLN-La(Ⅲ)對細(xì)胞株MCF-7，BEL7404和NIC-460具有顯著的體外抗腫瘤活性， PLN-La(Ⅲ)的抗腫瘤活性較配體PLN的明顯增強(qiáng)，特別是對細(xì)胞株BEL7404的活性比順鉑還高，其IC50值為6.11 μmol·L-1，為了研究藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合機(jī)理并解釋其分布，藥理特性及在血漿中的藥物代謝，我們采用紫外光譜和熒光光譜等方法研究PLN和PLN-La(Ⅲ)與牛血清白蛋白的相互作用.

圖1 白花丹素和白花丹素鑭(Ⅲ)配合物的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structures of PLN (a) and PLN-La(Ⅲ)(b)

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Perkin-Elmer FT-IR傅立葉紅外光譜儀(美國Perkin Elmer公司)，Bruker AV-500核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司)，Perkin Elmer Series II CHNS/O 2400元素分析儀(Perkin Elmer公司)，Varian Cary100紫外-可見光譜儀(美國Varian公司)，F(xiàn)luoro Max-4熒光分光光度計(天美(中國)科學(xué)儀器有限公司)，pHS-3C型精密酸度計(上海雷磁儀器廠). 牛血清白蛋白(Sigma公司)，用pH=7.4的Tris-HCl緩沖溶液配制成5.0×10-5mol/L的儲備液保存于4 ℃的冰箱中備用，金屬鹽LaCl3·6H2O(Sigma公司)與其他試劑均為分析純，實驗用水為二次蒸餾水.

1.2 實驗方法

1.2.1 配合物的PLN-La(Ⅲ)的合成

將0.1 mmol(56.4 mg)PLN的乙醇溶液(15 mL)加入到0.1 mmol(33.5 mg)LaCl3·6H2O的水溶液(15 mL)中. 將此混合物回流攪拌2 h，在回流過程中產(chǎn)生紫色沉淀，冷卻至室溫并過濾. 該固體用水和乙醇洗滌，空氣中干燥兩天. 產(chǎn)率: 0.41 g (55.5%); 元素分析，分子式La(C11H7O3)3(H2O)2，理論值： C 54.21%， H 3.21%；測量值： C 53.82%， H 3.42%. IR (KBr, cm-1): 3 433, 1 642, 1 610, 1 251, 1 424, 614. ESI-MS:m/z737.6 [M+H]+. UV-Vis (DMSO):λmax=265 nm,λmax=420 nm.

1.2.2 熒光發(fā)射光譜

移取2 mL濃度為1×10-5mol/L的BSA溶液(Tris-HCl-NaCl緩沖溶液作溶劑)于1 cm的石英比色皿中，用微量注射器逐漸向該溶液中加入相同體積(30 μL/次)濃度為3×10-4mol/L的化合物溶液(二甲基亞砜作溶劑)，每次加液后充分混合并靜置5 min，以280 nm為激發(fā)波長，發(fā)射狹縫寬度均為5.0 nm，分別測量298 K與310 K溫度下，BSA在波長為290～500 nm的熒光發(fā)射光譜.

1.2.3 同步熒光光譜

同步熒光光譜是同時掃描激發(fā)和發(fā)射兩個單色器波長得到的. 在298 K溫度下，240～360 nm波長范圍內(nèi)在Δλ=15 nm 和Δλ=60 nm測定純BSA、BSA與PLN、BSA與PLN-La(Ⅲ)在不同濃度下的發(fā)射峰強(qiáng)度及峰位.

1.2.4 紫外吸收光譜

在190～500 nm波長范圍內(nèi)測定BSA與化合物物質(zhì)的量之比為1∶1的紫外吸收光譜.

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅光譜

圖2是PLN和PLN-La(Ⅲ)與BSA作用的熒光光譜圖，圖3是PLN-BSA(A)和PLN-La(Ⅲ)-BSA(B)熒光猝滅常數(shù)曲線圖. 隨著PLN與PLN-La(Ⅲ)逐漸加入到BSA溶液中，BSA的熒光發(fā)射強(qiáng)度有規(guī)律地逐漸減弱， PLN與PLN-La(Ⅲ)對BSA的熒光產(chǎn)生猝滅作用. 同時發(fā)現(xiàn)，在PLN-La(Ⅲ)與BSA作用的熒光光譜圖中，在波長約420 nm處產(chǎn)生的一個較弱的熒光發(fā)射峰，且其熒光強(qiáng)度隨著PLN-La(Ⅲ)溶液的逐漸加入逐漸增強(qiáng)，這個峰是PLN-La(Ⅲ)配合物本身的熒光發(fā)射峰[11].

c(BSA) =1.0×10-5 mol·L-1, c(PLN or La (Ⅲ) complex) = 3.0×10-4 mol·L-1, 30 μL/次圖2 PLN-BSA(A)和La (Ⅲ) complex-BSA(B)相互作用的熒光發(fā)射光譜圖Fig.2 Emission spectra of BSA with various amounts of PLN (A) and La (Ⅲ) complex (B)

圖3 PLN-BSA(A，B)和PLN-La(Ⅲ) -BSA(C,D)熒光猝滅常數(shù)曲線圖Fig.3 Stern-Volmer quenching constants of BSA with various amounts of PLN (A,B) and PLN-La(Ⅲ) (C,D)

為了研究PLN和PLN-La(Ⅲ)對BSA結(jié)構(gòu)的影響，我們分別測定了PLN和PLN-La(Ⅲ) 與BSA作用的同步熒光光譜. 一般來說，牛血清白蛋白的熒光主要是由酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的殘基引起的[12]. 牛血清白蛋白的熒光光譜對這些發(fā)色基團(tuán)的小環(huán)境比較敏感. 如圖4所示，在PLN和PLN-La(Ⅲ)存在下，BSA中的酪氨酸殘基和色氨酸殘基的熒光強(qiáng)度明顯降低. 然而，酪氨酸和色氨酸殘基的發(fā)光峰值位置沒有發(fā)生顯著的偏移，表明酪氨酸和色氨酸殘基周圍的極性沒有發(fā)生改變. 因此，化合物沒有明顯影響B(tài)SA的構(gòu)象. 同時發(fā)現(xiàn)，在PLN-La(Ⅲ)與BSA作用的同步熒光光譜圖4 B2中，在波長約320 nm處產(chǎn)生了一個較弱的熒光發(fā)射峰，且其熒光強(qiáng)度隨著PLN-La(Ⅲ)溶液的逐漸加入而增強(qiáng)，這個峰是PLN-La(Ⅲ)配合物本身的熒光發(fā)射峰[11]，提示 PLN-La(Ⅲ)與BSA結(jié)合飽和后產(chǎn)生游離的化合物.

c(BSA) =1.0×10-5 mol·L-1, c(PLN or PLN-La(Ⅲ)) = 3.0×10-4 mol·L-1, 50μL/次圖4 不同濃度下PLN-BSA(A) 和PLN-La(Ⅲ)-BSA(B)的同步熒光光譜圖Fig.4 Synchronous fluorescence spectra of BSA with various amounts of PLN (A) and PLN-La(Ⅲ) (B)

2.2 熒光猝滅機(jī)理研究

為了進(jìn)一步研究PLN和PLN-La(Ⅲ)對BSA熒光猝滅的機(jī)理，通過Stern-Volmer方程對熒光猝滅數(shù)據(jù)進(jìn)行分析：

F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+Ksv[Q]

(1)

其中，F(xiàn)0和F分別是不加和加入猝滅劑后蛋白的熒光強(qiáng)度，Kq為擴(kuò)散碰撞猝滅速率常數(shù)，τ0為無猝滅劑時熒光分子的熒光壽命，其值為10-8s，[Q]為猝滅劑的濃度，Ksv為雙分子動態(tài)猝滅常數(shù). 為了分析猝滅機(jī)理，我們首先假定此熒光猝滅過程是一個動態(tài)熒光猝滅過程[13-14].

圖3顯示的是在不同溫度下PLN和PLN-La(Ⅲ)對BSA的熒光猝滅Stern-Volmer曲線. 表1列出了相應(yīng)的動態(tài)猝滅常數(shù)Ksv和猝滅速率常數(shù)Kq. 結(jié)果表明，猝滅常數(shù)Ksv隨著溫度的升高而降低，在298 K的溫度下，PLN的猝滅常數(shù)為1.87×1015， PLN-La(Ⅲ)猝滅常數(shù)為1.127×1015，而在310 K的溫度下，PLN的猝滅常數(shù)為4.227×1014，PLN-La(Ⅲ)猝滅常數(shù)為5.45×1014，同時，猝滅速率常數(shù)Kq遠(yuǎn)大于不同猝滅劑對生物大分子的最大散射碰撞猝滅常數(shù)(2.0×1010L·mol-1·s-1). 因此，可以推斷，BSA的內(nèi)源性熒光的猝滅機(jī)制可能不是一個動態(tài)猝滅過程[15].

從表1也可以看出，在298 K時，PLN-La(Ⅲ)的猝滅常數(shù)小于PLN的猝滅常數(shù)，表明由于La(Ⅲ)離子與BSA結(jié)合，會影響PLN與BSA結(jié)合的能力. 因此，結(jié)合常數(shù)的降低縮短了藥物在血漿中的貯存時間并提高其最大的效果. 較小的結(jié)合常數(shù)可能有以下兩個方面的原因：其一是金屬離子和PLN與BSA結(jié)合存在著競爭，金屬離子可能降低了PLN與BSA結(jié)合的能力；其二是La(Ⅲ)離子引起了BSA的構(gòu)象變化，使得PLN與BSA更難結(jié)合. PLN-La(Ⅲ)與BSA結(jié)合能力比PLN的弱，這更有利于提高PLN-La(Ⅲ)在有機(jī)體內(nèi)的抗腫瘤活性.

表1 不同溫度下PLN和PLN-La(Ⅲ)對BSA的熒光動態(tài)猝滅常數(shù)Ksv和猝滅速率常數(shù)KqTable 1 Stern-Volmer quenching constants for the interaction of PLN and PLN-La(Ⅲ) with BSA at different temperatures

2.3 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

根據(jù)F?rster偶極-偶極能量轉(zhuǎn)移理論，生物化學(xué)的能量轉(zhuǎn)移效率可以用來評估配體(受體)和蛋白質(zhì)BSA(供體)之間的距離[16]. 能量轉(zhuǎn)移效率(E)不僅和受體與供體間的距離有關(guān)，而且和臨界能量轉(zhuǎn)移距離R0有關(guān)，它們之間有下列關(guān)系：

(2)

其中，F(xiàn)和F0分別為存在和不存在受體時BSA的熒光發(fā)射強(qiáng)度，r是供體偶極中心與受體偶極中心之間的距離，R0為能量轉(zhuǎn)移效率E=50%時的臨界距離，R0可以通過下列式子求算：

.8×10-25K2n-4φJ(rèn)

(3)

其中，偶極的空間取向因子K2=2/3，介質(zhì)的折射指數(shù)n=1.36，供體BSA的熒光量子產(chǎn)率φ=0.15[17]，受體紫外吸收光譜與供體BSA熒光光譜重疊積分J可以由下列的式子計算：

(4)

圖5分別是PLN和PLN-La(Ⅲ)的紫外吸收光譜和BSA的熒光發(fā)射光譜的重疊圖，J，r，R0和E的計算值列于表2中. 從表2看出，PLN-La(Ⅲ)的r值比配體PLN的高(rPLN=1.63 nm，r(PLN-La(Ⅲ))=2.04 nm)，r<8 nm，因此可以推斷BSA與PLN之間以及BSA與PLN-La(Ⅲ)之間均存在有F?rster偶極-偶極非輻射能量轉(zhuǎn)移[18].

表2 PLN和PLN-La(Ⅲ)對BSA的J，r, R0和E計算值Table 2 The calculated values of J, r, R0 and E of BSA with PLN and La(Ⅲ) complexes

T=298 K. (A) PLN-BSA, c(BSA)=c(PLN)=1.0×10-5 mol·L-1; (B) PLN-La(Ⅲ)-BSA, c(BSA)= c(PLN)=1.0×10-5 mol·L-1圖5 PLN或PLN-La(Ⅲ)的紫外吸收光譜(2)和BSA的熒光發(fā)射光譜(1)的重疊圖Fig.5 Overlap between the fluorescence emission spectrum of BSA (1) and UV absorption spectrum of PLN or PLN-La(Ⅲ) (2)

結(jié)論:化合物和與牛血清白蛋白(BSA)的相互作用研究表明，PLN和PLN-La(Ⅲ)均可通過靜態(tài)熒光猝滅的方式減弱牛血清白蛋白(BSA)的熒光強(qiáng)度，PLN-La(Ⅲ)與BSA的親和力及結(jié)合常數(shù)比PLN的弱，提示金屬離子和PLN對BSA的結(jié)合存在著競爭關(guān)系，降低了PLN與BSA結(jié)合的能力；或者誘導(dǎo)了BSA的構(gòu)象變化，導(dǎo)致PLN更難與BSA結(jié)合. 研究結(jié)果有助于理解PLN和PLN-La(Ⅲ)在體內(nèi)血液中的分布情況，以及PLN-La(Ⅲ)比PLN具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性的作用機(jī)制.

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