益氣活血法對大鼠局灶性腦缺血縫隙連接蛋白表達的影響＊

林 海 周 輝 劉 煜 林 宏 西安市中醫(yī)院腦病科（西安710001）

△ 第四軍醫(yī)大學唐都醫(yī)院神經(jīng)內科（西安710000）

◇西安市第五人民醫(yī)院（西安710000）

腦梗塞是最常見的缺血性腦血管病，由于血管狹窄或閉塞阻斷血流而引起局部腦組織壞死。有關缺血性腦卒中損傷的發(fā)病機理，近年研究發(fā)現(xiàn)［1］膠質細胞在梗塞灶周圍缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元的損害中發(fā)揮重要作用，無論膠質細胞對神經(jīng)元的損害，還是遲發(fā)性神經(jīng)元死亡都與它們之間的縫隙連接蛋白（connexin，Cx）密切相關。缺血性腦卒中屬于中醫(yī)“中風”范疇，中醫(yī)認為該病是由于氣血逆亂，產(chǎn)生風、火、痰、瘀，導致腦脈痹阻。多數(shù)醫(yī)家認為氣虛血瘀是其主要發(fā)病機制之一，臨床上活血類中藥制劑應用廣泛，已被證實具有良好的治療及預防作用。腦梗塞中醫(yī)治療中益氣、活血類中藥制劑聯(lián)合使用文獻報道較少，其具體作用機制目前仍不明確。本實驗研究從縫隙連接蛋白Cx43、CX32在大鼠缺血后膠質細胞及神經(jīng)元中的表達情況，從分子角度揭示益氣活血理論指導下的中藥制劑（黃芪注射液、川芎嗪注射液）在治療或改善缺血性腦損傷中的可能機制，同時為益氣、活血中藥制劑的在臨床中聯(lián)合應用提供一定的理論支持。

1 材料與方法1.1 試劑與器材 RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒與PCR試劑盒（Takara公司），隨機引物（北京奧科生物合成），瓊脂糖凝膠（Biowest公司），Cx32，Cx43抗體（Santa公司），二抗與DAB顯色試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），Trizol（Invitrogen公司）。低溫冷凍離心機（法國 Heraeus公司），PCR儀與電泳儀（Biorad公司），培清JS－680C全自動凝膠成像系統(tǒng)（上海培清科技有限公司），成像所用軟件（Sensi－Capture公司），ECL發(fā)光儀（美國UVP公司）。

1.2 模型的建立及分組 雄性Sprague－Dawley大鼠70只（由第四軍醫(yī)大學實驗動物研究中心提供，許可證號：SCXK陜（2010－04）），體重200～250g，適應性喂養(yǎng)1周后采用王健等［2］方法制作氣虛血瘀證動物模型。實驗第11天，按改進的Longa線栓法制作不開顱大鼠大腦中動脈阻塞（MCAO）模型，術后用青霉素4萬單位/只，腹腔注射以抗感染。動物清醒后①不能完全伸展對側前爪者；②爬行時出現(xiàn)向對側轉圈者；③行走時身體向對側倒者；④大鼠活動能力下降，為手術成功標志。

70只大鼠隨機分為4組：空白對照組（n＝10），模型組，黃芪＋川芎嗪組，川芎嗪組12h、24h各10只。

1.3 標本采集 于相應時間點，各組大鼠用0.4%戊巴比妥鈉（10mL/kg）腹腔麻醉，經(jīng)左心室至升主動脈插管，先以150mL生理鹽水快速沖洗，繼之以冷的（4℃）含40g/L多聚甲醛的0.1mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，pH7.4）先快后慢灌流固定2h，然后取出前腦置蔗糖（200g/L）中4℃直至組織沉底。取一份缺血腦組織經(jīng)過脫水，浸蠟，用切片機切制腦梗塞灶的連續(xù)冠狀切片（片厚5μm），切片分組收集，備行HE染色及免疫組化。取一份缺血腦組織，分置液氮保存，提取RNA及總蛋白。

1.4 免疫組織化學染色 切片經(jīng)0.01mol/L PBS漂洗3×10min后入含30mg/LTriton X－100的PBS 30min（室溫）；經(jīng)1∶3000小鼠抗Cx43血清（Sigma）或1∶3000兔抗Cx43血清（Sigma）孵育24h（室溫）；再經(jīng)生物素標記的抗血清IgG（1∶500，Sigma）室溫下孵育2h；生物素－卵蛋白－HRP復合物（ABC，1∶500，Sigma）室溫下孵育2h；葡萄糖氧化酶－DAB－硫酸鎳銨法呈色，常規(guī)貼片、干燥、脫水透明、封片。每步驟后均用0.01mol/L KPBS（pH7.4）充分洗滌。

1.5 RT－PCR檢測 Cx43、Cx32mRNA表達 取部分腦組織，Trizol一步法提取總RNA，按試劑盒說明一步法逆轉錄為cDNA，再進行PCR擴增。根據(jù)Genbank查詢目的基因序列 ，Primer 5.0設計引物 ，GAPDH 為內參照 ，引物序列（Cx43上游引物：5’－GCGGCTTGCTGAGAACCT AC－3’and下游引物 ，5’－CAGTGG TGGCGTGGTAAG GA－3’，反應產(chǎn)物309bp；GAPDH 上游引物：5’－GAA ACC TGC CAA GTA TGA TG －3’and 下游引物：5’－ACCAGGAAATGAGCTTTA CA－3’，反應產(chǎn)物 191bp。Cx32上游引物：5’－CTGCTCTACCCGGGCTATGC－3’和下游引物：5’－CAGGCTGAGCATCGG TCG CTCTT－3’，擴增片段長度389bp）。用凝膠成像系統(tǒng)掃描分析 ，以內參GAPDH mRNA條帶光密度值作為標準 ，計算Cx43mRNA表達的相對量。

1.6 Western－blot分析蛋白表達 取部分缺血腦組織，加入組織裂解液，與低溫環(huán)境中采用勻漿器進行研磨10min，冰上放置30min，然后再研磨5min。將研磨的勻漿導入離心管中，進行低溫冷凍離心25min（12000rpm，4℃），棄沉淀，取部分上清與上緩沖液混合，沸水浴中煮沸8min，1000rpm離心5 min，取上清，進行SDS－PAGE蛋白凝膠電泳，取目的條帶，濕轉法轉到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2h。加入一抗，4℃孵育過夜。經(jīng)含0.1%Tween－20的PBST溶液洗后，加入熒光鼠抗（1∶1000），室溫孵育1h。采用UVP成像分析系統(tǒng)進行掃描，測定目的蛋白條帶的積分密度值，以β－actin作為內參組。計算Cx43與Cx32基因表達的相對量。

1.7 統(tǒng)計學方法 測得的數(shù)據(jù)應用SPSS13.0for Windows統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，實驗結果以均數(shù)（±s）表示，組間比較用t檢驗。

2 結 果2.1 各組大鼠不同時間點神經(jīng)功能缺損評分 各組大鼠術后神經(jīng)行為學評分顯著高于空白對照組（P＜0.01）；模型組于12h時間點神經(jīng)行為學評分達到高峰，24h時間后逐漸下降；黃芪注射液＋川芎嗪注射液組各時間點較模型組相比神經(jīng)功能缺損評分均減少（P＜0.05）。見表1。

表1 各組神經(jīng)行為學評分（±s）

表1 各組神經(jīng)行為學評分（±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05

10 0 0 0模型組 10 2.78±0.52 2.53±0.55 2.22±0.61黃芪＋川芎嗪組 10 2.69±0.48 1.71±0.62△ 1.59±0.55△川芎嗪組 10 2.81±0.50 1.98±0.59△C 12h 24h空白對照組組 別 n 1.61±0.51

2.2 免疫組化

2.3 Western Blot檢測Cx43、Cx32蛋白變化

2.4 RT－PCR檢測Cx43、Cx32mRNA表達

A、B、C、D、E、F、G分別表示空白對照，模型組，黃芪注射液＋川芎嗪注射液12h、24h，川芎嗪注射液12h、24h組Cx43的表達情況

A、B、C、D、E、F、G分別表示空白對照，模型組，黃芪注射液＋川芎嗪注射液12h、24h，川芎嗪注射液12h、24h組Cx32的表達情況

表2 Western Blot檢測膠質細胞Cx43、神經(jīng)元Cx32蛋白表達（±s，n＝10）

表2 Western Blot檢測膠質細胞Cx43、神經(jīng)元Cx32蛋白表達（±s，n＝10）

注：▲P＜0.01VS空白對照組；△P＜0.05VS相應時間點模型組

Cx43 Cx32組 別12h 24h空白對照組 18.24±3.09 19.89±3.32 12h 24h模型組 31.59±2.99▲ 23.07±2.80▲ 30.57±3.38▲ 24.19±3.11▲黃芪＋川芎嗪組 22.58±3.12△ 15.21±2.75△ 21.01±2.87△ 16.55±2.86△川芎嗪組 24.66±2.83△ 18.54±2.61 22.98±2.57△19.07±2.91

如表2所示、結合圖1可以看出，相對于空白對照組，模型組Cx43與Cx32的表達量明顯升高（P＜0.01）。黃芪＋川芎嗪組較模型組12h、24h能夠明顯下調Cx43與Cx32的表達（P＜0.05）。川芎嗪組較模型組12hCx43、Cx32下調明顯（P＜0.05），24h不明顯（P＞0.05）。

表3 RT－PCR檢測膠質細胞Cx43mRNA、神經(jīng)元Cx32mRNA表達（±s）

表3 RT－PCR檢測膠質細胞Cx43mRNA、神經(jīng)元Cx32mRNA表達（±s）

注：▲P＜0.01VS空白正常組；△P＜0.01VS相應時間點模型組

Cx43 Cx32組 別12h 24h空白對照組 13.11±2.24 17.59±2.47 12h 24h 23.79±2.11模型組 31.66±1.87▲ 19.84±2.31 40.57±2.27▲ 30.65±2.33黃芪＋川芎嗪組 15.98±2.09△ 13.01±1.75△ 22.55±2.66△ 17.89±2.39△川芎嗪組 17.60±2.24△ 17.29±1.98 26.51±2.49△

圖1 局灶性腦缺血后膠質細胞Cx43、神經(jīng)元Cx32western Blot結果

圖2 腦缺血后膠質細胞Cx43mRNA RT－PCR結果

圖3 腦缺血后神經(jīng)元Cx32mRNA RT－PCR結果

如表3、圖2、圖3所示可以看出：相較于正常組，模型組Cx43、Cx32mRNA含量明顯增加（P＜0.01）。黃芪＋川芎嗪組與模型組12h、24h相比Cx43mRNA、Cx32mRNA含量明顯減少（P＜0.05）。與模型組比較川芎嗪組12hCx43mRNA、Cx32mRNA下調有統(tǒng)計學差異（P＜0.05），24h則不明顯（P＞0.05）。

3 討 論中醫(yī)研究中，大多數(shù)學者傾向于認為氣虛血瘀是缺血性中風的主要病因病機。清代醫(yī)家王清任在《醫(yī)林改錯》中更明確指出：“人過半百元氣已虛，氣虛無力推動血行，使之瘀血偏滯于體，乃罹患偏癱”，“元氣既虛，必不能達于血管，血虛無氣，必停留而瘀”，其治則應為益氣活血。根據(jù)這一理論本實驗選用黃芪注射液及川芎嗪注射液為實驗用藥，在模型制備中采用病證結合的大鼠模型即中醫(yī)氣虛血瘀模型和腦缺血模型相結合，力求實驗研究更符合中醫(yī)辨證施治的思想，使研究結果更加精確客觀。通過觀察兩藥合用及單用對缺血性腦損傷病理過程的影響，揭示中醫(yī)益氣活血理論針對缺血性腦損傷的可能機理。

現(xiàn)代醫(yī)學研究發(fā)現(xiàn)腦缺血早期梗塞面積會繼發(fā)性擴大，可能與通過縫隙連接（gap junction，GJ）的信號傳導有關，Lin等［3］認為GJ有利于引起細胞死亡的凋亡信號在死亡的神經(jīng)元與存活的神經(jīng)元間擴散，進一步加大腦缺血損害的范圍，阻斷GJ可減輕腦缺血損傷的程度?？p隙連接是相鄰細胞膜對應面上一對接合體構成的縫隙連接通道，可存在于相同細胞間和不同細胞間。近幾年研究發(fā)現(xiàn)縫隙連接不僅存在于星型膠質細胞間，而且也存在于神經(jīng)元與膠質細胞之間，使在各種刺激后神經(jīng)元與星型膠質細胞間進行信息交流成為可能。Cotrina等［4］的研究表明腦缺血時存活的星型膠質細胞間的GJ通道保持開放。有研究［5］發(fā)現(xiàn)在病理損傷情況下縫隙連接參與了損害過程。Mesnil等［6］發(fā)現(xiàn)轉染胸苷激酶的細胞會死亡，而且非轉染胸苷激酶的也細胞會死亡，認為這種旁觀者死亡現(xiàn)象與縫隙連接有關。Cx43敲除鼠碰傷后海馬CA1區(qū)損害明顯減輕。腦缺血后縫隙連接參與神經(jīng)元損傷的可能機理為梗塞灶中心和梗塞灶周邊細胞間的縫隙連接是清除缺血產(chǎn)生過多的Ca2＋、IP3等產(chǎn)物的重要途徑，過高的Ca2＋、IP3會引起星型膠質細胞和遠隔的神經(jīng)元異常興奮（spreading depression），梗塞灶周邊的細胞由于播散性抑制而處于去極化狀態(tài)，最后發(fā)生死亡［7］。

本研究結果顯示，黃芪注射液、川芎嗪注射液合用及川芎嗪注射液單用［8］，均可對缺血性腦損傷的病理過程產(chǎn)生一定影響，減輕神經(jīng)功能缺損的程度。主要表現(xiàn)在黃芪注射液聯(lián)合川芎嗪注射液、川芎嗪注射液單用可下調腦缺血后膠質細胞Cx43，神經(jīng)元Cx32的過度表達。從藥物聯(lián)合及單用結果分析，腦缺血后12h時Cx43、Cx32表達較同時段對照組明顯增高，黃芪注射液、川芎嗪注射液合用及川芎嗪注射液單用均可下調Cx43、Cx32表達，腦缺血后24h時黃芪注射液、川芎嗪注射液合用對Cx43、Cx32的表達仍能產(chǎn)生一定的抑制作用，而川芎嗪注射液單用則對Cx43、Cx32表達無明顯影響。神經(jīng)功能評定的結果表明，腦缺血后12h神經(jīng)行為學評分較對照組顯著增高，24h后逐漸減少。兩藥合用及單用均可在一定程度上改善大鼠腦缺血后的神經(jīng)行為學表現(xiàn)。同時觀察發(fā)現(xiàn)存在藥物合用較單用在神經(jīng)功能恢復的時間上要快。實驗結果表明益氣活血類中藥制劑治療或改善缺血性腦損傷的可能機理與腦缺血后的縫隙連接蛋白表達下調有關。同時結果顯示在影響縫隙連接蛋白的下調及神經(jīng)行為學評分中益氣、活血藥物伍用優(yōu)于活血藥物單用［9］，表明益氣、活血類藥物之間具有協(xié)同、互補的作用。

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