苦碟子對(duì)膿毒性急性腎損傷大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響作用

佟蘇東 史國(guó)輝 盧海源 河北省唐山市豐南區(qū)醫(yī)院內(nèi)五科（唐山063300）

△河北聯(lián)合大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科（唐山063009）

急性腎損傷（Acute Kidney Injury，AKI）是危重患者常見(jiàn)的臨床并發(fā)癥之一，其危害大，病死率高，可作為一項(xiàng)獨(dú)立危險(xiǎn)因素影響患者預(yù)后。AKI的病因是多因素的，但由膿毒癥（sepsis）引起者居高不下?；仡欉^(guò)去，盡管在治療和研究技術(shù)方面取得了許多進(jìn)步，但是對(duì)于膿毒癥相關(guān)AKI患者的預(yù)后沒(méi)有實(shí)質(zhì)性改變，其病死率仍在不斷增長(zhǎng)！原因可能與我們對(duì)膿毒癥相關(guān)急性腎損傷的發(fā)病機(jī)制了解不夠，近年來(lái)一些人提出氧化應(yīng)激反應(yīng)在急性腎損傷中起重要作用，并參與整個(gè)過(guò)程。認(rèn)為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腎小管功能障礙也是AKI的一個(gè)重要機(jī)制。本研究利用盲腸結(jié)扎穿孔（Cecal Ligation and Puncture，CLP）法復(fù)制大鼠膿毒癥致AKI模型，應(yīng)用苦碟子進(jìn)行藥物干預(yù)。比色法檢測(cè)腎功能及血清SOD、MDA改變，組織病理學(xué)觀察腎臟組織形態(tài)學(xué)變化；探討氧化應(yīng)激反應(yīng)在膿毒性腎損傷中的作用及苦碟子進(jìn)行藥物干預(yù)的影響，為臨床診治膿毒性急性腎損傷提供新的診斷思路和方法。

1 材料與方法1.1 材 料 48只健康雄性SD（Sprague－Dawle）大鼠，2月齡，平均體重250±20g，由河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。丙二醛（mal0ndialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 方 法 1.2.1 按 CLP法［1］制備大鼠膿毒癥模型并隨機(jī)分組；①空白對(duì)照組（Normal group，n＝12）：不給予任何處理，通過(guò)取眼球法采血，隨后直接處死；②假手術(shù)組（Sham group，n＝12，A組）：SD大鼠術(shù)前12h禁食，75%酒精消毒，10%水合氯醛3mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，腹部中線切口3cm，開(kāi)腹后顯露盲腸，翻動(dòng)腸管，牽拉盲腸，關(guān)腹，不結(jié)扎和穿孔盲腸。③盲腸結(jié)扎穿孔組（CLP group，n＝12，B組）：SD大鼠術(shù)前12h禁食，75%酒精消毒，10%水合氯醛3mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，腹部中線切口3cm，開(kāi)腹后顯露盲腸，在其根部用3—0號(hào)絲線結(jié)扎并用18G針頭貫穿盲腸2次，擠出少許腸內(nèi)容物后將腸管送入腹腔，然后逐層關(guān)腹，并于術(shù)后給予滅菌注射用水10mg/Kg一次性腹腔注射。④苦碟子干預(yù)組（CLP＋苦碟子組，n＝12，C組），手術(shù)同③，術(shù)后給以苦碟子10mL/Kg腹腔注射干預(yù)。各組在術(shù)后3h、6h、24h分別抽取4只通過(guò)取眼球法采血、并處死。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)采集血清及大鼠腎臟組織標(biāo)本。

1.2.2 血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）含量測(cè)定：采取眼底靜脈叢取血，用內(nèi)徑粗一些的毛細(xì)管，切成1.5～2cm的長(zhǎng)度，先用肝素潤(rùn)一下，不用麻醉直接單手固定大鼠，另一只手把毛細(xì)管從眼角插入，取血約1mL，倒入離心管中，常溫放置30min，離心3000轉(zhuǎn)/min，10min。取血清上生化自動(dòng)分析儀及配套試劑盒檢測(cè)血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）含量。

1.2.3 腎臟組織勻漿中MDA含量及SOD活性的測(cè)定：各組大鼠取左側(cè)腎臟－80℃保存，待所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將腎臟組織制成10%生理鹽水勻漿，4℃下3000r/min離心10 min，取上清，考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定法檢測(cè)腎臟組織勻漿液中蛋白濃度，按試劑盒操作說(shuō)明，分別檢測(cè)MDA含量及SOD活性。

1.2.4 腎臟病理學(xué)檢測(cè)：新鮮右側(cè)腎臟經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，HE染色，顯微鏡下觀察。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：所有計(jì)量資料數(shù)據(jù)應(yīng)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，對(duì)各組資料以SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，組間比較應(yīng)用單 因素方差分析（one－way ANOVA）及最小顯著差法（LSD），使用Pearson相關(guān)性分析分析參數(shù)之間的相關(guān)性。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果2.1 各組腎臟組織病理學(xué)改變 光鏡下見(jiàn)：A組無(wú)明顯病理改變，各結(jié)構(gòu)間界限清楚，腎小管上皮正常無(wú)明顯損傷，偶可見(jiàn)腎小管上皮細(xì)胞再生、脫落，無(wú)細(xì)胞的壞死現(xiàn)象。B組可見(jiàn)腎小球萎縮，球囊擴(kuò)張，腎小管內(nèi)皮腫脹、充血、出血，廣泛空泡變性；C組較B組病理明顯減輕。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)血清中肌酐的檢測(cè) CLP術(shù)對(duì)大鼠血清肌酐的影響及苦碟子的作用：3組大鼠在術(shù)后0h，血清肌酐差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與A組相比，B組在術(shù)后3h的血清肌酐值開(kāi)始上升，24h仍持續(xù)升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而C組在大鼠術(shù)后3h、6h、24h血肌酐升高情況較B組顯著減輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血肌酐指標(biāo)變化（umol/L±s）

表1 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血肌酐指標(biāo)變化（umol/L±s）

注：與 A組比較后，△P＜0.05；與B組比較后，▲P＜0.05

時(shí)間（h）組 別 n 0h 3h 6h 24h A組 12 22.88±2.76 25.50±2.42 30.50±3.62 40.00±6.63 B組 12 23.4±2.87 42.17±3.18△ 55.5±6.11△ 106.15±13.17△C組 12 23.89±2.71 37.84±4.55▲ 39.02±5.07▲ 63.02±11.61▲

2.3 各組大鼠各時(shí)間點(diǎn)腎組織勻漿中MDA、SOD的比較與A組比較，B組、C組大鼠CLP手術(shù)后3h、6h、24h腎組織MDA含量均顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與B兩組比較，C組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

與A組相比，B組、C組腎臟組織中SOD活力明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；C組SOD雖明顯低于A組，但與與B組比較，SOD水平有明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠腎組織勻漿中MDA、SOD的比較（n＝12，±s）

表2 各組大鼠腎組織勻漿中MDA、SOD的比較（n＝12，±s）

注：與 A組比較后，△P＜0.05；與B組比較后，▲P＜0.05

指標(biāo) T（h）A組 B組 C組3 0.99±0.13 1.25±0.21△ 1.09±0.15▲MDA 6 1.02±0.12 1.45±0.13△ 1.16±0.14▲（nmol/mgprot）24 1.06±0.15 1.86±0.13△ 1.32±0.13▲SOD（U/mgprot）3 6 2 4 15.77±1.20 16.32±1.6 16.87±2.08 11.09±1.13△10.55±1.55△8.21±1.55△13.99±2.21▲14.66±2.23▲13.41±1.91▲

3 討 論膿毒癥是感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（SIRS），嚴(yán)重者可引起膿毒癥休克（septic shock），甚至多器官功能障礙綜合征（MODS）。膿毒癥休克也稱感染性休克，是由革蘭陰性或陽(yáng)性細(xì)菌、立克次體、霉菌、病毒等病原微生物及其毒素等產(chǎn)物引起的人體有效循環(huán)血量急劇減少，組織血液灌注嚴(yán)重不足從而導(dǎo)致全身各重要器官和細(xì)胞的功能代謝障礙及結(jié)構(gòu)損害的一種急危重癥。腎臟是膿毒癥和膿毒癥休克最易受累的器官之一，AKI又是影響膿毒癥和膿毒癥休克患者疾病發(fā)生發(fā)展和預(yù)后的重要因素。膿毒癥（sepsiS）并發(fā)急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）是指膿毒癥患者發(fā)生急性腎實(shí)質(zhì)損傷，同時(shí)排除其他導(dǎo)致腎臟損害的因素（如腎臟缺血、腎毒性物質(zhì)等）。在膿毒癥人群中AKI發(fā)生并不少見(jiàn)，發(fā)生率隨著膿毒癥的嚴(yán)重度上升而增加。近年來(lái)，膿毒癥合并AKI治療方面有較多進(jìn)展，改善了該人群的預(yù)后。膿毒癥時(shí)，腎臟的內(nèi)皮細(xì)胞不僅被激活，產(chǎn)生炎性因子；同時(shí)也是炎性因子首要攻擊的靶細(xì)胞之一［2］。在臨床實(shí)踐中發(fā)現(xiàn)，膿毒癥一旦合并腎臟損害，治療難度明顯增加。內(nèi)毒素血癥ARF早期血管收縮可能與氧自由基有關(guān)，內(nèi)源性活性氧簇清除劑可減輕活性氧簇引起的腎小管和腎血管的損傷。氧自由基與NO作用產(chǎn)生有害的過(guò)氧化亞硝酸鹽，膿毒癥氧化相關(guān)的內(nèi)皮損害也是ARF的原因之一［3］。

本研究結(jié)果顯示：B組腎臟病理可見(jiàn)腎小球萎縮，球囊擴(kuò)張，腎小管內(nèi)皮腫脹、充血、出血，腎小管廣泛空泡化，Cr、BUN和腎組織中的MDA明顯升高，且MDA與Cr、BUN兩者呈顯著正相關(guān)。說(shuō)明膿毒癥發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腎臟存在著由氧化應(yīng)激反應(yīng)引起的氧化損傷。而且，氧化損傷是腎功能損害的主要原因。膿毒癥時(shí)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生大量的羥基（OH－），生成的OH－是最有害的自由基，會(huì)對(duì)機(jī)體造成氧化損傷［4］。

氧化應(yīng)激（Oxidative Stress，OS）是指機(jī)體在遭受各種有害刺激時(shí)，體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡，體內(nèi)高活性分子如活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和活性氮自由基（reactive nitrogen species，RNS）產(chǎn)生過(guò)多，氧化程度超出氧化物的清除，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)失衡，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，蛋白酶分泌增加，產(chǎn)生大量氧化中間產(chǎn)物，從而導(dǎo)致組織損傷。氧化應(yīng)激是由自由基在體內(nèi)產(chǎn)生的一種負(fù)面作用，并被認(rèn)為是導(dǎo)致衰老和疾病的一個(gè)重要因素。郭德玉等［5］認(rèn)為氧自由基是內(nèi)毒素血癥大鼠腎損傷的重要原因。近年研究發(fā)現(xiàn)，重度膿毒癥病人的器官功能障礙主要是功能性而非器質(zhì)性的，是由于其線粒體功能障礙而致組織氧耗量降低［6－7］，使組織細(xì)胞進(jìn)入乏氧代謝的過(guò)程，繼而導(dǎo)致細(xì)胞代謝障礙。呂杰等［8］研究了重度膿毒癥患者應(yīng)用中藥抗氧化劑可使氧供、氧耗和乳酸清除率得到明顯提高，組織氧代謝顯著改善。

我國(guó)目前尚缺乏膿毒癥、AKI相關(guān)臨床統(tǒng)計(jì)資料。結(jié)合我國(guó)中醫(yī)特色，制定了中醫(yī)學(xué)對(duì)膿毒癥AKI的認(rèn)識(shí)及中西醫(yī)結(jié)合防治策略，在對(duì)膿毒癥、膿毒癥AKI等的治療方面積累了豐富經(jīng)驗(yàn)。朱雪琦等［9］在查閱大量文獻(xiàn)和臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上，提出膿毒癥AKI的中醫(yī)防治策略：早期運(yùn)用“活血化瘀”法，可以在一定程度上防治膿毒癥AKI的發(fā)生和阻斷其進(jìn)展。

苦碟子，學(xué)名抱莖苦荬菜，為菊科苦荬菜屬植物。研究認(rèn)為，苦碟子的主要活性成分腺苷（Adenosine）及類似物，是一種ADP受體抑制劑，具有抗血小板聚集作用，可降低全血黏度、纖維蛋白原并改善管襻流態(tài)和襻周狀態(tài)；同時(shí)腺苷具有明顯的擴(kuò)張血管作用，能有效改善缺血缺氧，使組織器官的功能得到好轉(zhuǎn)。有研究證實(shí)，苦碟子對(duì)早期腎病腎小球具有保護(hù)作用，對(duì)微量白蛋白尿有減輕和預(yù)防作用［10－12］。文獻(xiàn)報(bào)道，Lu J等［13］在細(xì)胞水平也證實(shí)從苦碟子中提取的6種類黃酮成分均可抑制過(guò)氧化物的產(chǎn)生，可明顯減輕膿毒癥大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)，有明顯的抗氧化損傷作用，對(duì)腎臟起到保護(hù)作用，可顯著降低血清Cr，減輕腎組織炎細(xì)胞浸潤(rùn)、腎小球淤血和腎小管上皮細(xì)胞損傷。

綜上所述，膿毒癥可以引起急性腎損傷，并隨著病程延長(zhǎng)加重腎臟損害，通過(guò)測(cè)定膿毒癥大鼠腎組織MDA含量及腎臟組織中SOD活力及肌酐變化來(lái)觀察氧化應(yīng)激在膿毒性腎損傷的作用，說(shuō)明膿毒癥時(shí)存在著顯著的脂質(zhì)過(guò)氧化現(xiàn)象，而清除氧自由基的能力則明顯不足?？嗟幼⑸湟嚎娠@著抑制脂質(zhì)過(guò)氧化并提高其清除氧自由基的能力，對(duì)膿毒癥時(shí)組織氧自由基損傷的保護(hù)作用，有助于氧化應(yīng)激狀態(tài)的恢復(fù)，從而糾正膿毒癥的病理生理狀態(tài)，為膿毒癥的治療提供了新的途徑，對(duì)膿毒癥急性腎損傷的氧化應(yīng)激作用及中西醫(yī)結(jié)合臨床研究進(jìn)行思考，為膿毒癥急性腎損傷的防治提供新的思路。但本研究尚未涉及膿毒癥模型大鼠的最終預(yù)后，且本研究結(jié)果的深層次分子生物學(xué)機(jī)理亦不清楚，尚需進(jìn)一步深入研究。

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