配制結(jié)核含藥培養(yǎng)基藥液的保存條件探討

孫蕾 唐詩(shī)邈 王毳 李冰

我們觀察了結(jié)核分枝桿菌在保存于不同條件藥液(異煙肼、利福平、乙胺丁醇和鏈霉素)配制含藥培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況，試圖尋找配制結(jié)核含藥培養(yǎng)基藥液的理想保存環(huán)境，現(xiàn)將我們實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 方法

1.1 藥物選擇 分別選擇異煙肼(INH，100%)、利福平(RFP，98%)、乙胺丁醇(EMB，73.6%)和鏈霉素(SM，77%)，以上4種藥粉來(lái)自國(guó)家結(jié)核病參比實(shí)驗(yàn)室，再由遼寧省涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的痰培養(yǎng)獲得的已確認(rèn)的結(jié)核分枝桿菌40株菌株。

1.2 操作方法 將INH、RFP、EMB和SM分別配制成20 μg/ml、4000 μg/ml、200 μg/ml和 400 μg/ml的藥液，并分成四份。第一份藥液配制成含藥培養(yǎng)基，含藥培養(yǎng)基中的藥物濃度為:INH(0.2 μg/ml)、RFP(40 μg/ml)、EMB(2 μg/ml)和SM(4 μg/ml)。第二份藥液分別室溫放置1、3、7 d后，配成含藥培養(yǎng)基。第三份藥液分別冷藏放置1、3、7 d后，配成含藥培養(yǎng)基。第四份藥液冷凍(-20℃)1個(gè)月后，配成含藥培養(yǎng)基。取40株結(jié)核分枝桿菌傳代培養(yǎng)3周后，調(diào)成10-2mg/ml和10-4mg/ml的菌液，接種含藥培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4周，觀察結(jié)果，判斷結(jié)核分枝桿菌的耐藥性。同時(shí)還將10-2mg/ml的菌液分別接種不同保存條件藥液配制的含藥培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)4周，觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)核分枝桿菌在不同保存條件藥液配制含藥培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況比較 結(jié)核分枝桿菌在不同保存條件含異煙肼及利福平培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況比較見(jiàn)表1，結(jié)果表明兩組各種條件下陽(yáng)性率分布無(wú)明顯區(qū)別(P均＞0.05)。

結(jié)核分枝桿菌在不同保存條件含鏈霉素及乙胺丁醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況比較見(jiàn)表2，結(jié)果表明兩組各種條件下陽(yáng)性率分布無(wú)明顯區(qū)別(P均＞0.05)。

2.2 藥液保存時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)污染率的影響 表3為各種藥液不同保存時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)污染率的影響，結(jié)果表明，隨著各種藥液保存時(shí)間的延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)污染率都有所增加。

表1 結(jié)核分枝桿菌在不同保存條件含異煙肼及利福平培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況比較

表2 結(jié)核分枝桿菌在不同保存條件含鏈霉素及乙胺丁醇培養(yǎng)基中生長(zhǎng)狀況比較

表3 各種藥液不同保存時(shí)間對(duì)實(shí)驗(yàn)污染率的影響

3 討論

結(jié)核病是危害人類(lèi)健康常見(jiàn)疾病，過(guò)去臨床中常用抗結(jié)核菌一線藥物療效也漸不明顯，結(jié)核分枝桿菌耐藥是導(dǎo)致這些現(xiàn)象的重要原因之一，準(zhǔn)確地檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的耐藥性不但能為臨床提供診療依據(jù)，而且也為結(jié)核疾病流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供有效方法[1，2]。藥物敏感性試驗(yàn)[3]就是這類(lèi)方法之一，但其需要使用相應(yīng)含藥培養(yǎng)基，于是，尋覓配制含藥培養(yǎng)基藥液的最佳保存條件，達(dá)到既可避免藥物浪費(fèi)，又可方便含藥培養(yǎng)基配制途徑成了學(xué)者們的努力目標(biāo)。我們新近分別將40株結(jié)核分枝桿菌接種于用室溫、冷藏保持1 d、3 d、1周及冷凍保存1月藥液配制的含藥培養(yǎng)基上，另將結(jié)核分枝桿菌在當(dāng)天配制含藥培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況作為對(duì)照。我們發(fā)現(xiàn)，本研究方法與結(jié)核分枝桿菌在上述培養(yǎng)基上耐藥結(jié)果無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)區(qū)別，這提示，采用前一種方法保存藥液配制的含藥培養(yǎng)基比較適用于結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測(cè)。我們還證實(shí)，隨著藥液保存時(shí)間延長(zhǎng)，各類(lèi)藥物實(shí)驗(yàn)污染率有所增加，特別是異煙肼和乙胺丁醇藥液。因此，需加強(qiáng)配制藥液的無(wú)菌操作，采用滅菌的容器和蒸餾水配制藥液。

總之，通過(guò)妥善保存抗結(jié)核藥液，簡(jiǎn)化了含藥培養(yǎng)基的配制程序，降低了開(kāi)展結(jié)核分枝桿菌耐藥檢測(cè)的成本，有利于結(jié)核分枝桿菌耐藥監(jiān)測(cè)的開(kāi)展，為防治耐藥結(jié)核提供了簡(jiǎn)單、經(jīng)濟(jì)和實(shí)用的途徑。

[1]蔣云.肺結(jié)核病流行現(xiàn)狀和預(yù)防對(duì)策.基層醫(yī)學(xué)論壇，2012，16(7):922-923.

[2]趙玉玲，趙東陽(yáng)，李輝，等.7年結(jié)核分枝桿菌臨床分離株對(duì)一線和二線抗結(jié)核藥物耐藥趨勢(shì)監(jiān)測(cè).中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2010，20(2):338-340.

[3]中國(guó)防癆協(xié)會(huì)基礎(chǔ)專(zhuān)業(yè)委員會(huì).結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程.深圳:中國(guó)教育文化出版社，2006:46-51.