延經(jīng)丸對(duì)去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠E2、IL-1、IL-6 水平和腰椎組織病理學(xué)的影響*

趙粉琴，謝知慧，曹 勝，牟慧琴

(1．甘肅中醫(yī)學(xué)院中西醫(yī)結(jié)合婦科教研室，甘肅 蘭州730000;2．甘肅中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)醫(yī)療系婦科教研室，甘肅 蘭州730000;3．甘肅中醫(yī)學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)教研室，甘肅 蘭州730000)

骨質(zhì)疏松癥是圍絕經(jīng)期婦女的常見病、多發(fā)病。隨著老齡化社會(huì)的到來，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率成逐年上升趨勢(shì)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病主要是七七之年腎氣衰退，腎精虧虛，肝血不足，筋骨失于濡養(yǎng)所致。圍絕經(jīng)期女性由于卵巢功能衰退，雌激素水平急劇下降，骨的形成減少、吸收亢進(jìn)，導(dǎo)致骨量丟失加速，而造成骨質(zhì)疏松。導(dǎo)師牟惠琴教授通過長(zhǎng)期臨床經(jīng)驗(yàn)、本著“補(bǔ)腎健脾，陰陽互治”的原則而研制出治療絕經(jīng)前后諸證的經(jīng)驗(yàn)方藥延經(jīng)丸。為進(jìn)一步完善延經(jīng)丸防治圍絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制，本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用生物免疫技術(shù)，從細(xì)胞因子水平來探討延經(jīng)丸的作用機(jī)制，為臨床治療本病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 動(dòng) 物

6 月齡SPF 級(jí)Spragne-Dawley 雌性大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(甘)2004－0006。

1．2 藥品、試劑與儀器

延經(jīng)丸，由生地黃、熟地黃、菟絲子、紫河車、阿膠、枸杞子、白術(shù)、巴戟天、鹿角霜、山藥等組成，由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院提供，每袋含生藥20 g;9 g/L 生理鹽水，西安京西雙鶴藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)090524471;尼爾雌醇片，2 mg/片，北京四環(huán)制藥有限公司產(chǎn)品，批號(hào)20081101。雌二醇放射免疫試劑盒，天津新灣生物科技有限公司提供，批號(hào)20091201;白細(xì)胞介素1(IL-1) 放射免疫試劑盒(批號(hào)20090215)和白細(xì)胞介素－6(IL-6)放射免疫試劑盒(批號(hào)20091011)，由北京北方生物技術(shù)研究所提供。BS110S 型電子稱及051105 型電子分析天平，均為北京賽多利斯公司產(chǎn)品;KDC－2044 型低速冷凍離心機(jī)和GC－911 型放射免疫計(jì)數(shù)器，科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司產(chǎn)品;722 型22s 分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品;RM2135 型石蠟切片機(jī)、Primo 型電動(dòng)高速離心機(jī)及CX31－32L02 型光學(xué)顯微鏡，德國kendro 公司產(chǎn)品;TEC－VEM－J2 型石蠟包埋機(jī)及VIP－5Jr－J2 型石蠟脫水機(jī)，日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1．3 模型的建立與分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，按文獻(xiàn)法［1］進(jìn)行造模，100 g/L 水合氯醛5 μL/g 腹腔注射麻醉，取下腹部正中縱行切口(約1．5 cm)，切開皮膚，逐層分離皮下組織及肌肉筋膜進(jìn)入腹腔，于雙側(cè)腎下極處找到卵巢(粉紅色顆粒狀)，結(jié)扎并切除雙側(cè)卵巢，分層縫合肌肉、皮膚。假手術(shù)組手術(shù)路徑同手術(shù)組，但僅切除雙側(cè)卵巢旁各一塊脂肪組織。術(shù)后肌注青霉素1 次(8 萬U/只)，以預(yù)防感染。手術(shù)過程順利，未見大鼠死亡。摘除卵巢后5 d，逐只進(jìn)行陰道涂片檢查，1 次/d，連續(xù)5 d，以通過陰道脫落細(xì)胞檢查證明去勢(shì)成功。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均采用普通飼料喂養(yǎng)。

將造模成功的48 只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型對(duì)照組，尼爾雌醇組，延經(jīng)丸高、低劑量組4 組，每組12 只。另設(shè)假手術(shù)組12 只。

1．4 給藥方法

各組均在術(shù)后第7 天開始灌胃給藥。按人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體表面積比計(jì)算動(dòng)物等效給藥量。尼爾雌醇組給予尼爾雌醇1 μg/g(相當(dāng)于成人日臨床用量2 mg/60 kg 體質(zhì)量的10 倍)灌胃，使用前配成混懸液(濃度為0．167 g/L)，1 次/周。延經(jīng)丸給藥高、低劑量依次給予1．8，0．45 mg/ g (依次相當(dāng)于成人日臨床用量6，1．5 倍)，以蒸餾水配成180 g/L 和45 g/L，灌胃給藥，1 d 1 次。用藥組灌胃10 μL/(g·d)相應(yīng)藥液，假手術(shù)組和模型對(duì)照組灌胃等體積蒸餾水。連續(xù)給藥4 周。

1．5 標(biāo)本采集與處理

末次給藥24 h 后，100 g/L 水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈采血8 h 內(nèi)分離血清，按照參考文獻(xiàn)［2］進(jìn)行血液處理，樣品置冰箱待測(cè)。實(shí)驗(yàn)方法按照參考文獻(xiàn)［2］進(jìn)行。處死大鼠，取第4 腰椎，剔除肌肉組織;置于100 g/L 福爾馬林溶液中固定24 h;在甲酸中浸泡至完全脫鈣;經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋，沿矢狀面切開，切片厚度5 μm，常規(guī)HE 染色。

1．6 檢測(cè)指標(biāo)

血清激素和細(xì)胞因子水平測(cè)定:采用放射免疫方法測(cè)定血清E2、IL-1 和IL-6 水平，操作步驟根據(jù)試劑盒說明書。骨質(zhì)組織測(cè)定:光鏡下觀察骨組織結(jié)構(gòu)。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17．0 統(tǒng)計(jì)分析軟件處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)() ± 標(biāo)準(zhǔn)差(s)表示，采用單因素方差分析(ANOVA)分析，采用LSD 法進(jìn)行組間兩兩比較。以P＜0．05 為差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 各組大鼠血清E2、IL-1 和IL-6 水平對(duì)比

與假手術(shù)組對(duì)比，模型對(duì)照組血清E2水平降低，IL-1 和IL-6 水平增高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)，說明成功復(fù)制大鼠雌激素低落骨質(zhì)疏松模型。與模型對(duì)照組對(duì)比，尼爾雌醇組及延經(jīng)丸高、低劑量組的血清E2水平升高、IL-6 水平下降(P＜0．05或P＜0．01))，而IL-1 水平雖下降，但差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．01)。延經(jīng)丸兩劑量組血清E2、IL-6 和IL-1 水平與尼爾雌醇組對(duì)比，差別均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。延經(jīng)丸兩劑量組間3 個(gè)指標(biāo)對(duì)比，差別亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0．05)。結(jié)果表明:延經(jīng)丸高、低劑量的作用與尼爾雌醇相當(dāng);各治療組體內(nèi)雌激素水平上升緩慢，不能達(dá)到未絕經(jīng)前的水平。見表1。

表1 各組大鼠血清E2、IL-1 和IL-6 水平對(duì)比 ±s

表1 各組大鼠血清E2、IL-1 和IL-6 水平對(duì)比 ±s

注:與模型對(duì)照組對(duì)比，* P ＜0．05，＊＊ P ＜0．01。灌胃給藥時(shí)有5 只大鼠死亡。

組 別 動(dòng)物數(shù) E2/(ng·L －1) IL-1/(μg·L －1) IL-6/(μg·L －1)假手術(shù)組 11 13．57 ±11．22＊＊ 0．08 ±0．02＊＊ 55．28 ±20．32＊＊模型對(duì)照組 12 2．66 ±0．98 0．12 ±0．04 109．51 ±34．77尼爾雌醇組 10 5．47 ±1．83* 0．10 ±0．04 74．15 ±13．52＊＊延經(jīng)丸高劑量組 10 6．8 ±10．25* 0．09 ±0．04 65．76 ±24．09＊＊延經(jīng)丸低劑量組 12 4．56 ±7．96* 0．09 ±0．04 66．69 ±37．10＊＊

2．2 各組大鼠骨組織形態(tài)學(xué)觀察

第4 腰椎骨組織切片顯示:模型對(duì)照組大鼠骨小梁明顯變細(xì)、數(shù)目減少、排列稀疏，骨小梁間距增大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)缺如，呈典型的骨質(zhì)疏松改變，說明造模成功。假手術(shù)組大鼠骨小梁豐富、連續(xù)、致密。各治療組與模型對(duì)照組相比，骨小梁明顯多于模型對(duì)照組，排列較整齊，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)相對(duì)完整。見圖1。

圖1 各組大鼠第4 腰椎骨骨質(zhì)病理觀察(HE×10)

3 討 論

圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后期骨質(zhì)疏松的特點(diǎn)是伴隨絕經(jīng)的骨量加速丟失。圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后期雌激素水平下降，肝、腎合成活性維生素D 的功能下降，導(dǎo)致腸鈣吸收下降;此外，雌激素水平下降，使甲狀旁腺激素活性增加，從而使破骨細(xì)胞活躍，骨吸收增加，骨轉(zhuǎn)換加快，導(dǎo)致骨量的快速丟失，造成骨小梁變細(xì)，骨皮質(zhì)結(jié)構(gòu)破壞并漸進(jìn)性變薄，骨強(qiáng)度下降［3］，因此，雌激素缺乏是圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后期骨質(zhì)疏松的主要病理基礎(chǔ)。大量的研究表明: IL-1、IL-6 是強(qiáng)有力的骨吸收刺激因子［4－6］，在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松發(fā)生過程中起著非常重要的作用。在正常情況下，雌激素除了本身對(duì)骨吸收有抑制作用外，還對(duì)IL-1、IL-6 等骨吸收刺激因子也有一定的抑制作用，從而使骨吸收與骨形成維持在相對(duì)的平衡狀態(tài)，使骨進(jìn)行著正常的代謝。雌激素缺乏可使這些抑制遭到一定程度的解除，使IL-1、IL-6 等骨吸收刺激因子的活性異常增高，由此造成骨的過度吸收，骨量的大量丟失，進(jìn)而導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病的發(fā)生以腎虛為主要因素，并與肝脾、氣血相關(guān)，治療上以補(bǔ)腎為主。

牟慧琴教授根據(jù)多年的臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為:腎虛是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病的關(guān)鍵，脾胃虛弱與肝血不足是本病發(fā)生的基礎(chǔ)。延經(jīng)丸中以生地黃、熟地黃、鹿角霜、枸杞子、巴戟天、菟絲子和紫河車補(bǔ)腎壯陽，益精生髓，陰陽雙補(bǔ)，符合腎藏精，寓水火與一臟的理論;枸杞子、阿膠補(bǔ)養(yǎng)肝血;白術(shù)、山藥健脾益氣，以補(bǔ)后天之氣，提高人體消化吸收的能力。該組方從多臟腑補(bǔ)益調(diào)節(jié)著手，以補(bǔ)腎陰為主，陰陽并補(bǔ)，健脾益氣為輔，先天與后天相輔相成，體現(xiàn)了中醫(yī)的整體觀念的思想。根據(jù)肝腎同源，精血同源的理論，腎精充足，肝血有藏，骨髓得養(yǎng)，骨質(zhì)則強(qiáng)健。

本研究顯示:延經(jīng)丸可增高去卵巢骨質(zhì)疏松模型大鼠血清E2水平，從而增加骨質(zhì)吸收，減少骨質(zhì)破壞;同時(shí)可使IL-1、IL-6 的表達(dá)減少、活性降低，從而使兩者介導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化增殖功能減弱，骨吸收減少。

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