HPLC法測(cè)定坤靈丸中芍藥苷的含量

郭 強(qiáng)，王 梅

(1.河南省食品藥品檢驗(yàn)所，河南 鄭州450003；2.河南省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，河南鄭州450004)

坤靈丸是《中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑》第十冊(cè)中的品種［1］，由香附(制)、甘草、白薇、益母草、黃芪、雞冠花、麥冬、五味子、地黃、紅花、川木通、白術(shù)(炒)、赤石脂、茯苓、厚樸、肉蓯蓉(制)、白芍(酒炒)、荊芥、牡丹皮、阿膠、當(dāng)歸、藁本、紅參、鹿角膠、川貝母、沒藥(炒)、砂仁、延胡索、小茴香(鹽制)、龜甲膠、川芎等32味純中藥組成的復(fù)方制劑，具有調(diào)經(jīng)止血、逐瘀生新的功能，用于月經(jīng)不調(diào)、行經(jīng)腹痛、子宮寒冷、久不受孕、習(xí)慣性流產(chǎn)等癥的治療。原標(biāo)準(zhǔn)無含量測(cè)定項(xiàng)目，通過研究，制定了高效液相色譜法測(cè)定白芍和牡丹皮中芍藥苷的含量［2］。該方法簡(jiǎn)便，快速，靈敏，重現(xiàn)性好，可用于該產(chǎn)品質(zhì)量控制。

1 藥品、試劑與儀器

坤靈丸樣品由河南廣宇博科生物制藥有限公司提供，批號(hào)為050624，050625，050626。芍藥苷對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，為含量測(cè)定用對(duì)照品，批號(hào)為110736-200630；乙腈為色譜醇，供流動(dòng)相配制用，Merck公司產(chǎn)品；水為超純水；甲醇為分析純。安捷倫1 100高效液相色譜儀，配四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、VWD紫外檢測(cè)器，G1314B；KQ-300型超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司產(chǎn)品。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(實(shí)驗(yàn)中用Agilenttm C184.6 mm ×250 mm，5 μm)，乙腈 － 水(13∶87)為流動(dòng)相，體積流量 1.0 mL/min，柱溫35℃。理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算應(yīng)不低于2 000。

在此條件下對(duì)芍藥苷對(duì)照品溶液、坤靈丸供試品溶液進(jìn)行測(cè)定，HPLC色譜結(jié)果均較為理想，同法制備的坤靈丸陰性樣品(即不含白芍和牡丹皮藥材的坤靈丸)測(cè)定結(jié)果則為陰性，即未見與芍藥苷對(duì)照品保留時(shí)間相一致的吸收峰，說明其他藥材對(duì)樣品測(cè)定無干擾。色譜圖見圖1。

2.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液：精密稱取芍藥苷對(duì)照品14.96 mg，置100 mL量瓶中，加入甲醇溶液使溶解，并稀釋至刻度，搖勻；精密量取10 mL，置100 mL量瓶中，加入甲醇溶液使溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得(每1 毫升中含芍藥苷14.96 μg)。

供試品溶液：取本品適量，除去包衣，研細(xì)；取約3 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中；精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率 250 W，頻率50 kHz)40 min，放冷；再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

圖1 芍藥苷對(duì)照品、樣品、缺白芍和牡丹皮藥材的陰性樣品的HPLC色譜圖

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系考察

取芍藥苷對(duì)照品溶液，分別制成濃度為2.34，4.68，9.35，18.7，37.4，74.8 μg/mL 的 6 個(gè)樣品，分別吸取上述溶液各10 μL進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以峰面積積分值對(duì)進(jìn)樣量進(jìn)行回歸處理，芍藥苷在0.023 4 ～0.748 0 μg范圍內(nèi)，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。回歸方程為 Y=95.05X+1005.78，r=0.999 99。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取同一芍藥苷對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，連續(xù)測(cè)定6次(進(jìn)樣量10 μL)，測(cè)得峰面積積分值分別為 1021.326，1015.941，1016.043，1022.053，1019.959，1019.852，結(jié)果平均峰面積積分值為1019.196，RSD=0.26%(n=6)。結(jié)果表明：該方法精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液，按上述色譜條件分別在第0，2，4，6，8 h 各進(jìn)樣 1 次，每次進(jìn)樣 10 μL，測(cè)得峰面積積分值分別為 1035.405，1040.253，1032.568，1030.476，1042.635，結(jié)果平均峰面積積分值為1036.267，RSD=0.49%(n=5)。結(jié)果表明：供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重現(xiàn)性試驗(yàn)

取同一批號(hào)的樣品(批號(hào)為050624)6份，按含量測(cè)定方法試驗(yàn)，結(jié)果測(cè)得每1 g樣品中含芍藥苷分別為 0.28，0.27，0.26，0.28，0.27，0.29 mg，結(jié)果平均含量為 0.28 mg/g，RSD=3.81%(n=6)。結(jié)果表明：該法重現(xiàn)性較好。

2.3.5 回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的本品(批號(hào)050626，芍藥苷含量 0.30 mg/g)6 份，每份約1.5 g，精密稱定，精密加入芍藥苷對(duì)照品溶液(0.023 9 mg/mL)20 mL，以下按供試品溶液的制備項(xiàng)下方法制備加樣供試品溶液。按上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果見表1。計(jì)算回收率，平均回收率為 99.66%，RSD=1.56%(n=6)。

表1 芍藥苷回收率測(cè)定結(jié)果

2.4 樣品測(cè)定

按含量測(cè)定方法測(cè)定3批樣品中芍藥苷的含量，結(jié)果見表2。

表2 3批樣品測(cè)定結(jié)果 n=3

3 討論

本文建立了高效液相色譜法測(cè)定坤靈丸中芍藥苷含量的方法。該方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，快速靈敏，重現(xiàn)性好，可用于該產(chǎn)品定量控制。

3.1 含量測(cè)定方法的建立依據(jù)

本方由31味中藥組成，功效為調(diào)經(jīng)養(yǎng)血、逐瘀生新，用于月經(jīng)不調(diào)(或多或少)、行經(jīng)腹痛、久不受孕、習(xí)慣性流產(chǎn)、赤白帶下、崩漏不止、病久氣虛、腎虧腰痛等癥的治療。方中白芍平肝止痛，養(yǎng)血調(diào)經(jīng)，斂陰止汗，用于治療頭痛眩暈，脅痛，腹痛，四肢攣痛，血虛萎黃，月經(jīng)不調(diào)，自汗，盜汗；牡丹皮清熱涼血，活血化瘀，用于治療溫毒發(fā)斑，夜熱早涼，無汗骨蒸，經(jīng)閉痛經(jīng)，癰腫瘡毒，跌撲傷痛。這兩味藥功效與本品一致，原標(biāo)準(zhǔn)無含量測(cè)定項(xiàng)，參照相關(guān)文獻(xiàn)［3－10］，經(jīng)試驗(yàn)建立了用高效液相色譜法測(cè)定白芍、牡丹皮中芍藥苷的含量。該方法操作簡(jiǎn)便、結(jié)果準(zhǔn)確，可作為本品成品的質(zhì)控方法。

3.2 提取條件的選擇

根據(jù)芍藥苷的理化性質(zhì)，芍藥苷在甲醇中溶解度比較大，故選用甲醇作為芍藥苷的提取溶劑。對(duì)加入甲醇的體積進(jìn)行了考察并優(yōu)選合適的加入量，通過比較并考慮到容量管的容量，最后選定甲醇的加入量為25 mL；同時(shí)又對(duì)超聲時(shí)間進(jìn)行了考察優(yōu)選，超聲處理時(shí)間比較了20，40，60 min，考慮到將樣品中芍藥苷提取完全即可，最后確定超聲時(shí)間為40 min。最后確定加入甲醇25 mL，超聲處理40 min能夠?qū)⒈酒分猩炙庈仗崛⊥耆?，根?jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果把優(yōu)選出的方法確定為本品中白芍、牡丹皮中芍藥苷的提取方法。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［M］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：96.

［2］中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑：第十冊(cè)［M］.北京：中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部，1994：84.

［3］王巧，劉榮霞，畢開順，等.HPLC法測(cè)定白芍總苷膠囊中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷［J］.中草藥，2005，5(11)：1630.

［4］冀蘭鑫，傅俊曾，黃浩，等.赤芍中氧化芍藥苷和芍藥苷的含量測(cè)定［J］.亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥，2010，8(7)：18.

［5］羅云.HPLC法測(cè)定歸芎合劑中芍藥苷的含量［J］.內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2009，18(6)：42.

［6］張良，王珊，閔盛.HPLC法測(cè)定治偏痛顆粒中芍藥苷的含量［J］.中國(guó)實(shí)用醫(yī)藥，2007，2(18)：74.

［7］李偉，張建軍，王衛(wèi)茜.高效液相色譜法測(cè)定白芍藥材中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量［J］.中藥與臨床，2011，2(6)：8.

［8］惠婷婷，夏忠庭，張?zhí)m蘭.HPLC法測(cè)定郁舒顆粒芍藥內(nèi)酯苷和芍藥苷的含量［J］.陜西中醫(yī)，2012，33(4)：480.

［9］劉翔.HPLC法同時(shí)測(cè)定麻仁丸中芍藥苷、柚皮苷及橙皮苷的含量［J］.中國(guó)藥品標(biāo)準(zhǔn)，2010，11(6)：442.

［10］孟憲波，鄭暉.HPLC法測(cè)定柴芍丸中芍藥苷、梔子苷及丹皮酚的含量［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜質(zhì)，2011，17(17)：72.