褪黑素對(duì)大鼠急性脊髓損傷后不同時(shí)期IL-10表達(dá)的影響

徐玉生，李星晨，金偉林，馬玉斐，曾冠楠，王培松

鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院骨科 鄭州 450052

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)后大量的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和大量炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生是導(dǎo)致脊髓漸進(jìn)性潰變的主要因素[1]。有學(xué)者[2]報(bào)道，SCI后多種細(xì)胞因子明顯上調(diào)，其參與并調(diào)節(jié)損傷誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在繼發(fā)性損傷的病理過程中起著重要作用。研究[2-4]發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞介素-10(interleukin-10，IL-10)可對(duì)SCI脊髓組織中NF-κB表達(dá)和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)產(chǎn)生影響，從而減輕炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)[3]證實(shí)褪黑素對(duì)多種器官損傷后的炎癥反應(yīng)有抑制作用，但對(duì)SCI后神經(jīng)細(xì)胞周圍炎癥反應(yīng)及修復(fù)的作用尚不明確，特別是對(duì)細(xì)胞因子IL-10的分泌作用至今未闡明。作者通過觀察SCI后一次性注射人褪黑素制劑，觀察脊髓和血液中IL-10的變化，探索褪黑素誘導(dǎo)內(nèi)源性IL-10的表達(dá)對(duì)SCI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)健康成年雄性SD大鼠108只，體質(zhì)量(220±20)g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(豫)2010-0002。在通風(fēng)、適宜溫度和濕度的動(dòng)物室內(nèi)常規(guī)飼養(yǎng)1周。實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)動(dòng)物的處置符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

1.2主要試劑及儀器Trizol試劑、RT試劑盒(編號(hào)：AE101-01)和PCR試劑盒(編號(hào)：AP111-12)均購自Transgene公司，引物購自北京博大泰克公司，大鼠IL-10 ELISA試劑盒購自美國(guó)RD公司，兔抗鼠IL-10抗體、DAB試劑盒和SP9002免疫組化試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，褪黑素、DEPC和EB購自美國(guó)Sigma公司。PCR GeneAmp System(美國(guó)Applied Biosystems公司，型號(hào)：2700)，低溫離心機(jī)(美國(guó)Sigma公司，型號(hào)：3K30)，圖像記錄分析系統(tǒng)(大連Jim-X Scientific，型號(hào)：D-140)，LE ICACM 1900恒冷箱切片機(jī)。

1.3動(dòng)物模型的建立以體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉。大鼠取俯臥位，固定于操作臺(tái)上。術(shù)區(qū)備皮，常規(guī)消毒鋪巾，取后正中切口，以T12為中心顯露T11～13棘突和椎板，咬除T12節(jié)段椎板，暴露脊髓硬膜。硬膜上方放置一圓形塑料墊片(直徑6 mm)，再采用改良的Allen’s WD法，用預(yù)實(shí)驗(yàn)中確定的致傷質(zhì)量(5 g)的砝碼自距硬膜15 cm的高度沿導(dǎo)管垂直落下，造成大鼠SCI模型。造模成功的標(biāo)準(zhǔn)：打擊后鼠尾出現(xiàn)無規(guī)則的痙攣性擺動(dòng)、雙下肢呈回縮性撲動(dòng)，硬膜表面充血水腫。術(shù)畢以生理鹽水沖洗術(shù)野，再次消毒后常規(guī)縫合切口。

1.4動(dòng)物的分組及干預(yù)采用隨機(jī)數(shù)字表法將108只大鼠分為SCI組(A組)、褪黑素治療組(B組)和假手術(shù)組(C組)。A、B 2組按1.3的方法造模，10 min后分別按體質(zhì)量腹腔注射等體積的含體積分?jǐn)?shù)5%乙醇的生理鹽水和褪黑素(100 mg/kg)，對(duì)照組僅行椎板切除術(shù)而不損傷脊髓。各組大鼠每日均給予青霉素40萬U腹腔注射預(yù)防感染，A、B 2組術(shù)后給予人工輔助排尿、排便4～5次/d。

1.5BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分分別于術(shù)后第1、2、3、5、7天將大鼠置于評(píng)分操作臺(tái)上，環(huán)境適應(yīng)后由3位熟悉評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)但不知分組者獨(dú)立觀察4 min，取平均值作為評(píng)分結(jié)果。每時(shí)間點(diǎn)每組均隨機(jī)選取6只大鼠，評(píng)分后處死，取血清和脊髓組織備用。

1.6組織固定、取材及切片制備于術(shù)后第3天時(shí)每組中隨機(jī)選取6只大鼠，腹腔注射麻醉后行升主動(dòng)脈灌注(37 ℃的生理鹽水400 mL充分沖洗組織內(nèi)血液)，并以4 ℃ 40 g/L的多聚甲醛進(jìn)行固定，30 min后取出手術(shù)部位脊髓標(biāo)本，放置于40 g/L的多聚甲醛中室溫保存。用LE ICACM 1900恒冷箱切片機(jī)對(duì)脊髓組織作橫切面切片(6 μm厚)，載玻片收集組織后，恒溫烘箱烘干進(jìn)行HE染色及免疫組化SP法染色。

1.7血清中IL-10水平檢測(cè)采用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)血清中IL-10的含量。每例樣本取10 μL血清加入每個(gè)孔內(nèi)，按試劑盒流程說明進(jìn)行操作，最終于450 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(A)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中IL-10的含量。

1.8脊髓中IL-10mRNA表達(dá)的RT-PCR檢測(cè)

稱取100 mg凍存的脊髓組織，提取總RNA。大鼠IL-10上游引物序列5’-CAGTCAGCCAGACCCACAT-3’，下游引物序列5’-GGCAACCCAAGTAACCCT-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為141 bp 。內(nèi)參GAPDH上游引物序列5’-CAGTGCCAGCCTCGTCTCAT-3’，下游引物序列5’-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為595 bp。反應(yīng)體系RT-PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸6 min。取5 μL擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，在紫外線投射儀下觀察電泳條帶，記錄圖像后用D-140圖像記錄分析系統(tǒng)進(jìn)行分析，以目的基因和內(nèi)參條帶的灰度值的比值表示目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.9組織學(xué)觀察及IL-10蛋白表達(dá)的檢測(cè)HE染色觀察脊髓病理改變；免疫組化按 SP9002試劑盒說明書操作，中性樹脂封片。每個(gè)標(biāo)本取同序數(shù)切片6張，兔抗鼠IL-10抗體(按200倍稀釋)為一抗。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，細(xì)胞核和(或)胞質(zhì)染成黃褐色或黑色為陽性細(xì)胞。每張片計(jì)數(shù)高表達(dá)區(qū)3個(gè)高倍鏡視野中的陽性細(xì)胞個(gè)數(shù)，最后取算術(shù)平均數(shù)代表該標(biāo)本IL-10蛋白的表達(dá)水平。

1.10統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行分析。應(yīng)用單因素方差分析和LSD-t檢驗(yàn)比較3組大鼠BBB評(píng)分、血清中IL-10水平和脊髓組織中IL-10 mRNA及蛋白表達(dá)水平的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠的一般情況共108只大鼠，操作過程中A組3只、B組1只因麻醉過深后死亡，A組4只、B組2只造模不成功后踢出實(shí)驗(yàn)，后進(jìn)行同情況下補(bǔ)充。術(shù)后早期：A 、B 2組大鼠活動(dòng)及進(jìn)食明顯減少，C組較術(shù)前未有明顯改變；A、B 2組均出現(xiàn)后肢癱瘓，尿潴留情況。術(shù)后晚期：B、C 2組較A組大鼠活動(dòng)及進(jìn)食較好。取脊髓標(biāo)本見A組損傷部位出現(xiàn)潰瘍及大量的無菌性炎癥反應(yīng)；B組炎癥反應(yīng)較輕，未見潰瘍面。

2.2術(shù)后各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較

見表1。

表1 術(shù)后各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)BBB運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分比較 (n=6)

*與C組比較，P<0.01;#與A組比較，P<0.01。

2.3術(shù)后各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)血清中IL-10含量比較見表2。血清中IL-10水平從高到低依次為B組、A組、C組，且各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且A、B組術(shù)后第5天達(dá)到高峰。

*與C組比較，P<0.01;#與A組比較，P<0.01。

2.4術(shù)后各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)脊髓中IL-10mRNA表達(dá)水平比較見表3。脊髓中IL-10 mRNA表達(dá)水平各個(gè)時(shí)間點(diǎn)從高到低依次為B組、A組、C組，且各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，A、B 2組術(shù)后在第5天達(dá)到高峰。

2.5脊髓標(biāo)本HE染色和免疫組化染色結(jié)果見圖1。A、B 2組出現(xiàn)脊髓組織血管充血，B組較A組神經(jīng)細(xì)胞脫水變化輕，說明褪黑素可以減輕脊髓損傷后病理變化。免疫組化見IL-10在中央管附近的神經(jīng)細(xì)胞及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中分布較多，其中中央管室管膜細(xì)胞胞質(zhì)中也有較強(qiáng)表達(dá)。陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)從多到少依次為B組[(10.6±1.8) 個(gè)/HP]、A組[(9.1±1.4) 個(gè)/HP]和C組[(4.1±0.5) 個(gè)/HP]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=146.281,P<0.001)。各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

表3 術(shù)后各組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)脊髓中IL-10 mRNA表達(dá)水平比較 (n=6)

*與C組比較，P<0.01;#與A組比較，P<0.01。

圖1 各組大鼠脊髓HE染色和免疫組化染色結(jié)果

3 討論

急性脊髓損傷后脊髓組織主要有缺血、脂質(zhì)過氧化、離子的失衡、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子的釋放等表現(xiàn)。其中炎癥因子的大量產(chǎn)生和釋放是繼發(fā)性損傷的主要過程。有效地控制SCI后的炎癥反應(yīng)，盡可能地使繼發(fā)性損傷的程度降到最低，是改善預(yù)后的關(guān)鍵所在。

褪黑素是一類主要有松果體細(xì)胞分泌的肽類激素，具有調(diào)節(jié)時(shí)間節(jié)律、影響神經(jīng)內(nèi)分泌、調(diào)節(jié)體溫中樞等生理作用，并可減輕中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的毒性損害作用[5]。研究證實(shí)其對(duì)脊髓的保護(hù)作用主要是通過提高神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)作用[4，6]、減輕炎癥反應(yīng)[7]、減少細(xì)胞凋亡[8]來實(shí)現(xiàn)的。作者的前期實(shí)驗(yàn)[6]已經(jīng)證實(shí)100 mg/kg的褪黑素具有提高神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)、抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)作用。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SCI后100 mg/kg的褪黑素對(duì)大鼠食欲和精神狀態(tài)的改善較為明顯，可能與其有維持生物正常的晝夜節(jié)律、抗疲勞、焦慮、抑郁[9]和鎮(zhèn)痛[10]的作用有關(guān)。實(shí)驗(yàn)中觀察到在SCI晚期B組相對(duì)于A組未出現(xiàn)嚴(yán)重的無菌性炎癥反應(yīng)和潰瘍面，說明褪黑素對(duì)損傷后的脊髓保護(hù)作用是顯著的。

IL-10是一種可以抑制Th1細(xì)胞合成細(xì)胞因子的因子，被稱為細(xì)胞因子合成抑制因子(cytokine synthesis inhibitory factor，CSIF)[11]，SCI后其會(huì)反應(yīng)性的顯著增高[7]。Jackson等[12]研究證實(shí)IL-10能夠抑制早期炎癥反應(yīng)，特別是對(duì)SCI后細(xì)胞中的NF-κB轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用。局部膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、中央管周圍內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞在SCI后激活NF-κB[13]，通過自分泌和旁分泌途徑產(chǎn)生TNF、IL-1、IL-6和IL-8等因子，嚴(yán)重影響組織器官的修復(fù)[14]。這些細(xì)胞也產(chǎn)生抗炎性細(xì)胞因子IL-10[15]，并對(duì)NF-κB表達(dá)有明顯的抑制作用[16]，從而也抑制單核巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)[11-13]。打破這種平衡并增加抗炎因子分泌成為治療的首要途徑。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示血清中IL-10的表達(dá)量和脊髓中IL-10 mRNA的水平在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均有B組高于A、C 2組，并且在損傷后第5天出現(xiàn)高峰的現(xiàn)象，證明100 mg/kg的褪黑素能夠影響IL-10的表達(dá)，且能夠明顯提高高峰期的表達(dá)水平。免疫組化結(jié)果也證實(shí)了IL-10蛋白表達(dá)的部位及細(xì)胞主要集中在中央管周圍的室管膜細(xì)胞胞質(zhì)及神經(jīng)細(xì)胞和膠質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中。

總之，作者的研究結(jié)果可以直接和間接證明褪黑素能通過IL-10起到抗炎與脊髓神經(jīng)修復(fù)的作用。褪黑素對(duì)SCI大鼠體內(nèi)IL-10水平的作用是課題組研究的一個(gè)開端，作者對(duì)褪黑素的理解仍處在初級(jí)階段，其對(duì)SCI后的修復(fù)作用不僅僅是在一個(gè)炎癥因子方面。今后作者還將研究褪黑素對(duì)其他的炎癥因子的表達(dá)是否有類似的促進(jìn)作用等。褪黑素有可能成為繼甲強(qiáng)龍后的一個(gè)治療急性SCI的有效藥物[17-18]，因此認(rèn)為褪黑素的應(yīng)用前景非常廣闊。

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