接頭相關(guān)蛋白復(fù)合物3δ亞單位與BRD7的相互作用及其功能*

徐曉杰，周 鳴，李桂源#

1)南陽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校團(tuán)委 南陽 473000 2)中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所分子遺傳室 長(zhǎng)沙 410078

1997年作者所在的研究室運(yùn)用cDNA代表性差異分析方法克隆了一個(gè)在鼻咽癌活檢組織中表達(dá)下調(diào)的新基因BRD7(GenBank登錄號(hào)為AF152604，主要分布于胞核)[1]。轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)[2]顯示，BRD7基因具有抑制鼻咽癌細(xì)胞株HNE1生長(zhǎng)的作用，并可降低其成瘤性和體內(nèi)致瘤性。以余鷹博士為首的課題組[3]采用酵母雙雜交技術(shù)從人胎腦的cDNA文庫中篩選到一個(gè)與BRD7基因存在交互作用的接頭相關(guān)蛋白復(fù)合物3(adaptor-related protein complex 3,AP3)δ亞單位基因。作者首先構(gòu)建了2個(gè)AP3δ基因的真核表達(dá)載體，然后通過細(xì)胞免疫共定位和免疫共沉淀法觀察AP3δ蛋白與BRD7蛋白的交互作用；并采用半定量逆轉(zhuǎn)錄PCR、熒光素酶實(shí)驗(yàn)初步研究了AP3δ蛋白與BRD7蛋白在功能學(xué)上的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1主要材料和試劑質(zhì)粒和細(xì)胞系： 真核表達(dá)質(zhì)粒(pCMV-HA、pEGFP-C2)由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所分子遺傳室購買并保存，pACT2-AP3δ融合質(zhì)粒由余鷹博士提供，真核表達(dá)載體pCMV-Myc-BRD7由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所分子遺傳室構(gòu)建保存，E2F3啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒由周潔博士構(gòu)建，CyclinD1啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒購自Upstate公司。非洲綠猴腎COS7細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞庫，HNE1細(xì)胞株由中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院腫瘤研究所建立保存，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BRD7與空白載體pcDNA3.1(-)的HNE1細(xì)胞株由余鷹博士建立。主要試劑和抗體：RPMI 1640培養(yǎng)基、RNA抽提試劑Trizol購自GBICOL/BRL公司，脂質(zhì)體購自Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光素酶試劑盒購自Promega公司，小量膠回收試劑盒購自上海華舜生物工程有限公司，限制性內(nèi)切酶購自華美生物工程公司，所用抗體購自Santa Cruz公司和Pierce公司，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒和免疫共沉淀試劑盒購自Pierce公司。核苷酸引物的設(shè)計(jì)與合成：利用Goldkey軟件分析設(shè)計(jì)好的引物，確認(rèn)引物內(nèi)無發(fā)夾結(jié)構(gòu)，引物間無二聚體形成。相關(guān)引物(表1)由上海博亞生物公司設(shè)計(jì)合成。

表1 引物序列

1.2AP3δ基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建pACT2-AP3δ融合質(zhì)粒經(jīng)BgIⅡ單酶切，回收獲得目的片段AP3δ基因。pCMV-HA載體和pEGFP-C2載體經(jīng)BgIⅡ單酶切，并經(jīng)去磷酸化處理后，分別與目的片段連接，重組體再經(jīng)BgIⅡ單酶切鑒定插入成功與否。然后根據(jù)2個(gè)重組體的酶切圖譜，pCMV-HA-AP3δ選擇EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切鑒定插入片段的方向；pEGFP-C2-AP3δ選擇SalⅠ單酶切鑒定插入片段的方向。最后送樣品測(cè)序。

1.3AP3δ蛋白的亞細(xì)胞定位檢測(cè)6孔板中每孔接種約2×105個(gè)COS7細(xì)胞，細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～70%融合后，將2 μg pEGFP-C2-AP3δ加入100 μL無血清培養(yǎng)基中，再加入5 μL脂質(zhì)體，常規(guī)轉(zhuǎn)染30 h后，取出玻片固定，DAPI染色，觀察結(jié)果。

1.4AP3δ與BRD7在COS7細(xì)胞中的共定位檢測(cè)將pEGFP-C2-AP3δ與pCMV-Myc-BRD7經(jīng)1.3步驟共同轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。轉(zhuǎn)染30 h后取出玻片，清洗、風(fēng)干、固定后加入封閉血清4 ℃封閉1 h，吸干血清，將一抗anti-Myc均勻覆蓋于玻片表面，4 ℃孵育過夜，然后1×PBS清洗玻片4×15 min，將二抗cy3標(biāo)記的抗鼠 IgG均勻覆蓋于玻片表面，37 ℃孵育1 h，1×PBS清洗玻片4×15 min，DAPI染色，觀察結(jié)果。

1.5AP3δ蛋白與BRD7蛋白相互作用的觀察將pCMV-HA-AP3δ和pCMV-Myc-BRD7經(jīng)1.3步驟共同轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞。更換正常培養(yǎng)基24 h后，用預(yù)冷的1×PBS洗細(xì)胞2～3次，加入適量裂解緩沖液，冰上放置20 min； 用細(xì)胞刮子將細(xì)胞刮入裂解液，并移入預(yù)冷的Tube管中；12 000 r/min 4 ℃離心10 min，吸取上清至另一Tube管中，保存于-70 ℃。 抽提的蛋白樣品95～100 ℃煮5 min后行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜，麗春紅染色、封閉。孵育抗Myc抗體：1×PBS 中加入50 g/L蛋白干粉為抗體稀釋液， 滴度為0.5～1.0 mg/L，4 ℃搖床孵育過夜，用1×PBS洗膜4～5次，5 min/次；孵育抗HA抗體：在1×PBS 中加入50 g/L蛋白干粉為抗體稀釋液，二抗滴度為12 000，室溫2 h；用1×PBS洗膜4～5次，5 min/次。將等量的化學(xué)發(fā)光液A和B混合，加于膜上后壓片顯影。

1.6BRD7與AP3δ對(duì)COS7細(xì)胞中E2F3和CyclinD1活性的影響采用熒光素酶實(shí)驗(yàn)。取24孔板，每孔接種0.5×105個(gè)COS7細(xì)胞，24 h后細(xì)胞生長(zhǎng)至50%～70%融合狀態(tài)，按1.3轉(zhuǎn)染方法分2部分轉(zhuǎn)染。A部分分為4組，分別轉(zhuǎn)染E2F3啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒，E2F3啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒和pCMV-Myc-BRD7，E2F3啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒和pCMV-HA-AP3δ，E2F3啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒、 pCMV-Myc-BRD7和pCMV-HA-AP3δ。B部分同上分組，其中E2F3啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒換為CyclinD1啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒，余同。在2個(gè)實(shí)驗(yàn)中均加入β-Gal為內(nèi)對(duì)照，用來平衡轉(zhuǎn)染效率。倒掉細(xì)胞培養(yǎng)基，用1×PBS洗細(xì)胞2～3次；加入60 μL裂解緩沖液，室溫放置15～20 min后移入Tube管中，離心5～10 s；取20 μL細(xì)胞裂解物加入100 μL底物混勻，放入單光子檢測(cè)儀中進(jìn)行測(cè)定。棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用預(yù)冷的1×PBS洗滌細(xì)胞2～3次；加入50 μL裂解緩沖液，4 ℃搖床搖動(dòng)15 min，使細(xì)胞充分裂解；將細(xì)胞裂解液移入96孔板中，加入50 μL檢測(cè)緩沖液，混合，37 ℃孵育30 min；加入150 μL終止緩沖液終止反應(yīng)；用酶聯(lián)免疫標(biāo)記儀檢測(cè)酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7HNE1細(xì)胞中BRD7的重表達(dá)對(duì)AP3δmRNA表達(dá)水平的影響復(fù)蘇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-BRD7或pcDNA3.1(-)的HNE1，培養(yǎng)2～3 d后收集細(xì)胞，抽提RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，以此為模板進(jìn)行PCR。PCR反應(yīng)體系： MgCl23 μL，dNTP 4 μL，Buffer 5 μL，模板cDNA 5 μL，高保真酶 1 μL，AP3δ基因引物 0.1 mmol/L，ddH2O補(bǔ)至50 μL。當(dāng)AP3δ基因擴(kuò)增5個(gè)循環(huán)時(shí)，再加入內(nèi)對(duì)照GAPDH引物0.1 mmol/L進(jìn)行25個(gè)循環(huán)。PCR反應(yīng)參數(shù)：94 ℃ 5 min；94 ℃ 50 s，57 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，30個(gè)循環(huán);72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳，DNA膠回收試劑盒純化，操作方法按產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1重組體pCMV-HA-AP3δ和pEGFP-C2-AP3δ的鑒定AP3δ與pCMV-HA連接的重組體單酶切后產(chǎn)生3 800 bp和1 700 bp的2個(gè)片段(圖1)，正向插入的重組體雙酶切后產(chǎn)生4 500 bp、854 bp和140 bp的3個(gè)片段(圖2)。結(jié)果示2個(gè)克隆為陽性克隆，挑選其中1個(gè)克隆送測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示，重組體無序列錯(cuò)配和閱讀框架改變，表明pCMV-HA-AP3δ 構(gòu)建成功。AP3δ與pEGFP-C2連接的重組體單酶切后產(chǎn)生4 700 bp和1 700 bp的2個(gè)片段(圖3)，正向插入的重組體被SalⅠ單酶切后產(chǎn)生4 700 bp和1 700 bp的2個(gè)片段(圖4)，結(jié)果顯示1個(gè)克隆為陽性克隆，測(cè)序結(jié)果顯示，重組體無序列錯(cuò)配和閱讀框架改變，表明pEGFP-C2-AP3δ 構(gòu)建成功。

圖1 pCMV-HA-AP3δ重組體的單酶切鑒定

圖2 pCMV-HA-AP3δ重組體的雙酶切鑒定

圖3 pEGFP-C2-AP3δ重組體的BgI Ⅱ酶切鑒定

圖4 pEGFP-C2-AP3δ重組體的SalⅠ酶切鑒定

2.2AP3δ在COS7細(xì)胞中的亞細(xì)胞定位AP3δ蛋白在COS7細(xì)胞的胞質(zhì)、胞核中均有分布，但主要呈團(tuán)塊狀分布于胞核(圖5)。

圖5 AP3δ蛋白在COS7細(xì)胞中的定位

2.3AP3δ與BRD7在COS7細(xì)胞中的共定位

AP3δ與BRD7在COS7細(xì)胞中共定位于胞核(圖6)。

圖6 AP3δ與BRD7在COS7細(xì)胞中的定位

2.4AP3δ蛋白與BRD7蛋白的相互作用同時(shí)轉(zhuǎn)染pCMV-Myc-BRD7和pCMV-HA-AP3δ的COS7細(xì)胞中檢測(cè)到AP3δ蛋白的表達(dá)，AP3δ和空白載體共同轉(zhuǎn)染的COS7細(xì)胞中未檢測(cè)到AP3δ蛋白的表達(dá)(圖7)，說明AP3δ蛋白與BRD7蛋白存在相互作用。

2.5BRD7和AP3δ對(duì)COS7細(xì)胞中E2F3和CyclinD1活性的影響見表2、3。

圖7 AP3δ蛋白與BRD7蛋白的相互作用

表2 E2F3啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性相對(duì)值測(cè)定結(jié)果(n=3)

表3 CyclinD1啟動(dòng)子熒光報(bào)告質(zhì)粒熒光素酶活性相對(duì)值測(cè)定結(jié)果(n=3)

2.6HNE1細(xì)胞中BRD7的重表達(dá)對(duì)AP3δmRNA表達(dá)水平的影響與轉(zhuǎn)染空白載體的HNE1細(xì)胞相比，pcDNA3.1-BRD7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HNE1細(xì)胞中AP3δ mRNA的表達(dá)水平明顯上調(diào)(圖8)。

圖8 HNE1細(xì)胞中BRD7的重表達(dá)對(duì)AP3δ mRNA表達(dá)水平的影響

3 討論

鼻咽癌是我國南方地區(qū)高發(fā)的多基因遺傳性腫瘤，其發(fā)病機(jī)制和遺傳背景相當(dāng)復(fù)雜。作者所在的研究室前期工作[4]顯示BRD7很可能是鼻咽癌的一個(gè)遺傳易感基因，并通過酵母雙雜交系統(tǒng)從人胎腦的cDNA文庫中篩選出6種與BRD7蛋白存在交互作用的蛋白，其中AP3是由δ、β3、μ3、σ3四個(gè)亞單位構(gòu)成的異源四聚體，δ和β3為較大的蛋白鏈，且δ蛋白連接有各種附屬因子,可能是AP3中起主要功能的亞單位。利用生物信息學(xué)軟件對(duì)AP3δ的亞細(xì)胞定位情況進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)它具有一個(gè)核定位信號(hào)區(qū)域，分布在胞核的概率高達(dá)70%[5]。為了檢測(cè)單獨(dú)存在的AP3δ蛋白在細(xì)胞中的定位情況，該研究通過GFP介導(dǎo)的細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)觀察它的亞細(xì)胞定位，結(jié)果顯示，AP3δ蛋白在COS7細(xì)胞的胞質(zhì)、胞核中均有分布，但主要呈團(tuán)塊狀分布于胞核，與軟件的預(yù)測(cè)基本一致。明確COS7細(xì)胞中AP3δ主要定位于胞核后，作者進(jìn)一步采用熒光定位法觀察到AP3δ蛋白在COS7細(xì)胞胞核中與BRD7共同存在的現(xiàn)象；之后又采用免疫共沉淀的方法證實(shí)了BRD7與AP3δ蛋白存在相互作用。

作者所在的研究室的前期研究[4]發(fā)現(xiàn)，BRD7對(duì)鼻咽癌細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。 而BRD7主要是通過下調(diào)Ras/MEK/ERK和Rb/E2F兩條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性抑制細(xì)胞周期G1-S的進(jìn)程來發(fā)揮這一抑制作用[6]。E2F3和CyclinD1是Rb/E2F通路的兩個(gè)重要分子。該研究發(fā)現(xiàn)，與BRD7單獨(dú)作用相比，在AP3δ基因參與后，BRD7對(duì)E2F3和CyclinD1啟動(dòng)子活性的下調(diào)作用增強(qiáng)了50%左右，提示在BRD7下調(diào)Rb/E2F信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性的過程中，AP3δ能夠協(xié)同BRD7發(fā)揮功能。另外，在BRD7穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的HNE1細(xì)胞中，AP3δ mRNA的表達(dá)較空白載體轉(zhuǎn)染組有明顯上調(diào)，提示BRD7能夠促進(jìn)HNE1細(xì)胞中AP3δ mRNA的表達(dá)。諸多文獻(xiàn)[7-8]顯示，如果兩種蛋白存在交互作用，那么它們?cè)诠δ苌弦裁芮嘘P(guān)聯(lián)，共同參與某一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路或疾病發(fā)病過程。因此，該研究結(jié)果支持BRD7蛋白和AP3δ蛋白在功能上密切關(guān)聯(lián)、相互調(diào)節(jié)，可能共同參與了鼻咽癌的發(fā)病過程。但它們之間具體的作用機(jī)制如何以及它們相互作用的具體區(qū)域何在，仍有待進(jìn)一步的研究。

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