HCV核心蛋白對人肝癌細(xì)胞系SMMC-7721增殖的影響*

李志勤，孫長宇，余祖江，黃建敏，李建生，張 毅#

1)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科 鄭州450052 2)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生物細(xì)胞治療中心 鄭州 450052 3)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 鄭州 450052

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)為有包膜的單股正鏈RNA病毒，其編碼區(qū)只有一個開放閱讀框，編碼長3 010～3 030個氨基酸序列的蛋白前體，其中HCV核心蛋白是一種多功能蛋白，由191個氨基酸殘基組成, 在慢性丙型肝炎、丙型肝炎肝硬化及肝細(xì)胞癌的致病過程中起到重要作用[1]。HCV核心蛋白通過影響線粒體功能，致使與過氧化反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞生長相關(guān)基因表達(dá)異常；此外，HCV核心蛋白還通過調(diào)節(jié)細(xì)胞基因表達(dá),影響細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)(如MAPK途徑),從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子活化和細(xì)胞周期的異常[2]，但HCV的致癌機(jī)制尚不清楚。該研究將HCV核心蛋白質(zhì)粒轉(zhuǎn)染低侵襲性肝癌細(xì)胞系SMMC-7721，觀察其對該細(xì)胞系增殖能力的影響。

1 材料與方法

1.1材料pcDNA3.0-C-EGFP重組質(zhì)粒和pcDNA3.0(-)質(zhì)粒、細(xì)胞系SMMC-7721由鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院感染科孫長宇教授惠贈。TRIREAGENA(美國Molecular Research Centre公司)，200 U/mL Revert AIdTMHMinus M-MULV逆轉(zhuǎn)錄酶、5 U/mL Taq DNA聚合酶(華美生物公司)，驢抗羊抗體HCV核心蛋白抗體(美國Santa Cruz公司)，驢抗羊抗體、羊抗小鼠二抗(上?？党缮锕?，強(qiáng)化化學(xué)發(fā)光試劑盒(美國Pierce公司)，HCV核心蛋白 ELISA檢測試劑盒(科華生物公司)，MTT細(xì)胞增殖檢測試劑盒(上海吉泰生物公司)，細(xì)胞侵襲小室Transwell(孔徑8.0 μm)、濾膜(孔徑8.0 μm)均購自美國Costar公司，Matrigel(美國BD公司)，Rohe PCR儀、Bio-Rad電泳儀、電轉(zhuǎn)儀、96孔酶標(biāo)儀。

1.2細(xì)胞轉(zhuǎn)染將SMMC-7721細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)7%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中連續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2×105個細(xì)胞，過夜培養(yǎng)后，細(xì)胞分2組，分別進(jìn)行pcDNA3.0-C-EGFP 重組質(zhì)粒(觀察組) 和 pcDNA3.0(-)質(zhì)粒(空質(zhì)粒組)轉(zhuǎn)染，操作按照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染手冊進(jìn)行。

1.3轉(zhuǎn)染細(xì)胞HCV核心蛋白的檢測

1.3.1 RT-PCR法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞HCV核心蛋白的mRNA 細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，用Trizol試劑提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄得cDNA，以cDNA為模板，以β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。HCV核心蛋白引物序列如下：上游引物 5’-CGCGGATCCATGAGCACAAATCC-3’(1～14 bp)，下游引物5’-CCGGAATTCGCAAC CGGGC-3’(505～516 bp)。PCR反應(yīng)體系(50 μL):雙蒸水34.5 μL,10×緩沖液5 μL,dNTPs(25 mmol/L)4 μL,Mg2+3 μL,模板DNA(45 ng)1 μL ,上、下游引物(10 pmol/L)各1 μL,高保真Taq酶0.5 μL。反應(yīng)條件: 94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 10個循環(huán)；94 ℃ 30 s, 55 ℃ 30 s, 72 ℃ 30 s, 20個循環(huán)；72 ℃ 7 min。PCR產(chǎn)物于10 g/L瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，用凝膠成像系統(tǒng)照相分析。目的基因mRNA相對表達(dá)量=(目的基因條帶面積×顏色強(qiáng)度)/(β-actin條帶面積×顏色強(qiáng)度)。

1.3.2 Western blot法檢測轉(zhuǎn)染細(xì)胞HCV核心蛋白 收集轉(zhuǎn)染2～3 d后的細(xì)胞，加入裂解液后破碎，采用考馬斯亮藍(lán)G250方法測定蛋白質(zhì)濃度，取40 mg樣品，加等體積的上樣緩沖液后進(jìn)行電泳分離，轉(zhuǎn)膜，脫脂牛奶封膜2 h,加入HCV核心蛋白單克隆抗體(按1 000倍稀釋)溫育2 h,磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次，加入辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗小鼠二抗溫育1 h，PBST洗膜4次,用電化學(xué)發(fā)光顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色。用Quantity one軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值表示目的蛋白表達(dá)水平。

1.3.3 轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清中HCV核心蛋白的檢測

取轉(zhuǎn)染2～3 d后的細(xì)胞培養(yǎng)上清液100 μL，加入96孔板4 ℃包被過夜，硝酸鹽緩沖液洗板5次，37 ℃封閉1 h,PBST洗板5次，加入HCV核心蛋白抗體10 μL/孔，37 ℃ 1 h,甩盡板內(nèi)液體,用洗滌液洗滌反應(yīng)板并去除水滴(在厚疊吸水紙上拍干),反復(fù)洗滌5次。將辣根過氧化酶偶聯(lián)的驢抗羊抗體稀釋后，加入反應(yīng)孔內(nèi)，PBS洗板5次。每孔加入50 μL底物A和底物B,輕輕混勻30 s,室溫避光10 min。每孔加入100 μL終止液，輕輕振蕩30 s,30 min內(nèi)在450 nm處讀吸光度(A)值，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白表達(dá)量。

1.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞纖維連接蛋白黏附實(shí)驗(yàn)每孔100 μL纖維連接蛋白(10 mg/L)包被96孔板，以100 mg/L多聚賴氨酸和體積分?jǐn)?shù)1%牛血清白蛋白(BSA)包被孔作為最大和最小黏附參照。每孔加入5×104個轉(zhuǎn)染2～3 d后的細(xì)胞，37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2孵育2 h。用PBS洗滌除去未黏附細(xì)胞，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫溶液染色25 min，每孔加入400 μL 體積分?jǐn)?shù)0.5%TritonX-100過液，酶標(biāo)儀測定590 nm處的A值。細(xì)胞黏附率=(A樣品-ABSA包被)/(A多聚賴氨酸包被-ABSA包被)×100%。

1.5轉(zhuǎn)染細(xì)胞增殖率的檢測將轉(zhuǎn)染2～3 d 后的細(xì)胞分別按(1.5～2.0)×104/孔的密度接種于96孔板,每孔100 μL，設(shè)立陰性對照組。采用MTT法觀察細(xì)胞增殖情況，酶標(biāo)儀檢測波長為570 nm。每組8個復(fù)孔，重復(fù)3次。細(xì)胞增殖率=(實(shí)驗(yàn)組A-對照組A)/對照組A×100%。

1.6轉(zhuǎn)染細(xì)胞侵襲和運(yùn)動實(shí)驗(yàn)在Transwell上室加入100 μL Matrigel，37 ℃孵育2 h，加入無血清RPMI 1640稀釋的1×105個轉(zhuǎn)染2～3 d后的細(xì)胞懸液，下室加入500 μL 條件培養(yǎng)基；培養(yǎng)箱內(nèi)孵育48 h，取出上室用棉棒擦去Matrigel和未侵襲細(xì)胞，多聚甲醛固定10 min，Giemsa染色15 min，取下濾膜，于200倍光鏡下計(jì)數(shù)移至微孔膜下層的細(xì)胞(穿膜細(xì)胞數(shù))。每個樣本計(jì)數(shù)8個視野，取平均值。運(yùn)動試驗(yàn)中除不加Matrigel外，余同侵襲實(shí)驗(yàn)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。觀察組和空質(zhì)粒組HCV核心蛋白表達(dá)水平、細(xì)胞黏附率、侵襲和運(yùn)動實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)的比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 2組細(xì)胞HCV核心蛋白表達(dá)水平的比較2組細(xì)胞HCV核心蛋白mRNA、蛋白及培養(yǎng)上清HCV核心蛋白測定結(jié)果見表1?？梢钥闯觯^察組HCV核心蛋白表達(dá)水平高于空質(zhì)粒組。

表1 2組HCV核心蛋白表達(dá)水平的比較

2.2細(xì)胞增殖率的比較陰性對照組、空質(zhì)粒組和觀察組細(xì)胞增殖率分別為(20.4±2.1)%、(16.9±4.6)%和(46.5±3.3)%，3組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=68.231，P=0.001)，觀察組細(xì)胞增殖率明顯高于空質(zhì)粒組(P=0.002)。

2.3細(xì)胞黏附、侵襲和運(yùn)動實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察組細(xì)胞黏附率高于空質(zhì)粒組，侵襲和運(yùn)動實(shí)驗(yàn)穿膜細(xì)胞數(shù)大于空質(zhì)粒組，見表2。

表2 2組細(xì)胞黏附、侵襲和運(yùn)動實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討論

HCV核心蛋白除了與病毒核衣殼的組成有關(guān)以外，還參與病毒顆粒的裝配和釋放，并與宿主糖蛋白相互作用，完成病毒顆粒的成熟與分泌。HCV核心蛋白通過與細(xì)胞內(nèi)重要調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合，影響某些重要信號通路的傳遞，進(jìn)而直接參與宿主細(xì)胞的脂質(zhì)代謝、免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡以及細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程,與HCV感染后肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

大量研究[3-6]表明HCV核心蛋白能夠與介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的諸多相關(guān)信號分子相互作用,誘導(dǎo)或抑制細(xì)胞的凋亡,具體包括Fas抗原、Bcl-2B家族、淋巴毒素β受體等信號分子。抑制肝細(xì)胞凋亡一直被認(rèn)為是HCV核心蛋白導(dǎo)致肝細(xì)胞癌發(fā)生的重要機(jī)制之一。也有研究[7]證明HCV核心蛋白能激活或上調(diào)NF-κB的活性,NF-κB與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切,參與多種凋亡相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,具有抑制細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致細(xì)胞癌變的作用。羅瓊等[8]報(bào)道表達(dá)HCV核心蛋白的HepG2細(xì)胞系Cyclin D1和pRb/p130的表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞生長周期被抑制。另有報(bào)道[9]HCV核心蛋白通過增強(qiáng)Wnt/β信號傳導(dǎo)途徑導(dǎo)致肝癌細(xì)胞增長。該研究中，SMMC-7721細(xì)胞系是低侵襲性不轉(zhuǎn)移的人肝癌細(xì)胞系，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-C-EGFP 重組質(zhì)粒后高表達(dá)HCV核心蛋白；體外功能實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，轉(zhuǎn)染pcDNA3.0-C-EGFP 重組質(zhì)粒后，SMMC-7721細(xì)胞黏附、運(yùn)動和侵襲能力明顯增強(qiáng)，同時細(xì)胞增殖能力也明顯增強(qiáng)。由此推測HCV核心蛋白可以促進(jìn)SMMC-7721細(xì)胞系的增殖，HCV核心蛋白與HCV感染所致肝細(xì)胞癌的發(fā)生有直接關(guān)系，但HCV核心蛋白致人肝細(xì)胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化的具體分子機(jī)制還有待于進(jìn)一步的研究和闡明。

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