鑄造鈷鉻合金含銀抗菌涂層對(duì)L929細(xì)胞增殖及凋亡的影響*

梁銳英，趙 悅，徐艷麗，吳文慧﹟，孟 賀，趙 敏

1)河北聯(lián)合大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院口腔修復(fù)科 唐山 063000 2)清河縣人民醫(yī)院口腔科 邢臺(tái) 054800

鈷鉻合金以其生物性能和抗腐蝕性能良好、強(qiáng)度和硬度高、延伸率低、耐磨性好等特點(diǎn)成為臨床義齒修復(fù)應(yīng)用的主要材料。鈷鉻合金鑄造支架是活動(dòng)義齒修復(fù)的重要組成部分，也是口腔內(nèi)鏈球菌、乳桿菌、放線(xiàn)菌等多種條件致病菌容易沉積的位置。隨著義齒戴用時(shí)間的延長(zhǎng)，基牙患齲率以及義齒性口炎的發(fā)生率逐漸升高，采用藥物浸泡消毒解決這些問(wèn)題，存在抗菌廣譜、容易產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性及其他副作用等固有的局限性。銀系無(wú)機(jī)抗菌劑具有很好的生物安全性，是目前口腔科臨床材料改性中比較理想的抗菌材料，克服了傳統(tǒng)有機(jī)抗菌劑抗菌譜廣、易產(chǎn)生耐藥性等缺點(diǎn)。作者采用等離子噴涂方式制備了鈷鉻合金含銀抗菌涂層試件, 其具有良好的抗菌性能，但涂銀是否對(duì)鈷鉻合金的生物相容性產(chǎn)生影響并不清楚。該研究中，作者制備了鈷鉻合金含銀抗菌涂層試件浸提液，檢測(cè)其對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞L929細(xì)胞增殖和凋亡的影響，初步評(píng)價(jià)鈷鉻合金含銀抗菌涂層的生物學(xué)性能。

1 材料與方法

1.1試件制作與分組精密鑄造的規(guī)格為15 mm×15 mm×2 mm的正方形鈷鉻合金試件(德國(guó)BEGO公司)20個(gè)，利用萬(wàn)能工具磨床將所有試件切割成10 mm×10 mm×1 mm。其中10個(gè)試件表面應(yīng)用等離子噴涂的方法制作含銀抗菌涂層，所用噴涂材料為銀粉和鉻粉，由北京礦業(yè)研究院提供，質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3%和97%；剩余10個(gè)試件不做任何處理，作為對(duì)照。試件表面拋光后，經(jīng)無(wú)水乙醇超聲洗滌15 min，去離子水洗3次，烘干，121 ℃高壓滅菌后待用。

1.2浸提液的制備無(wú)菌條件下將2組試件置于24孔板中，以含體積分?jǐn)?shù)10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液為浸提介質(zhì)，參考GB/T 16886.12-2005(醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第12部分：樣品制備與參照樣品)，按試件表面積與浸提液體積比為1.25 cm2/mL，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱(日本Sanyo)中浸提24 h，浸提液經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾除菌后待用。

1.3浸提液對(duì)L929細(xì)胞毒性的測(cè)定用2.5 g/L胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司)消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞(天津塞爾生物技術(shù)有限公司)，配置細(xì)胞懸液，將懸液加入96孔板，并排接種6組，每組5孔，置于孵箱中孵育24 h后,棄去舊培養(yǎng)液，分別加入新鮮培養(yǎng)液(陰性對(duì)照組)，體積分?jǐn)?shù)100%、75%、50%、25%含銀抗菌涂層試件浸提液(含銀浸提液)和對(duì)照試件浸提液(對(duì)照浸提液)，每孔200 μL，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2、95%濕度的培養(yǎng)箱中分別孵育24、48和72 h。然后MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，用酶標(biāo)儀(美國(guó)BIO-RAD)在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔吸光度值，以生理鹽水孔作空白對(duì)照，計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率，參考GB/T 16886.5-2003(醫(yī)療器械生物學(xué)評(píng)價(jià)第5部分：體外細(xì)胞毒性試驗(yàn))，按相對(duì)增殖率評(píng)定材料毒性級(jí)別[1]。

1.4浸提液對(duì)L929細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L929細(xì)胞，胰蛋白酶消化后，用RPMI 1640培養(yǎng)液配成密度約為6.0×104mL-1的細(xì)胞懸液。將1 mL細(xì)胞懸液加入已有蓋玻片的6孔板中，每組6個(gè)復(fù)孔，放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，使細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。倒掉原培養(yǎng)液，實(shí)驗(yàn)分3組處理，分別加入含銀浸提液原液、對(duì)照浸提液原液和RPMI 1640培養(yǎng)液(陰性對(duì)照)1 mL，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5% CO2條件下培養(yǎng)48 h后，棄上清液，多聚甲醛室溫固定40 min，取出細(xì)胞爬片，中性樹(shù)膠粘于載玻片上， 37 ℃山羊血清封閉20 min。每張玻片滴加按100倍稀釋的一抗(鼠抗兔Bcl-2或Bax單克隆抗體)，陰性對(duì)照用PBS代替一抗，按說(shuō)明書(shū)操作，進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色。采用Image pro plus 6.0醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白表達(dá)強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。每張玻片選取5個(gè)高倍視野，測(cè)定每個(gè)視野下陽(yáng)性區(qū)光密度值(IOD)，取平均值，表示蛋白表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析對(duì)各組吸光度值、Bcl-2和Bax表達(dá)水平及Bcl-2/Bax進(jìn)行比較，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1細(xì)胞毒性測(cè)定結(jié)果各組吸光度值見(jiàn)表1。不同濃度的浸提液對(duì)L929細(xì)胞的毒性均為0～1級(jí)。

表1 各組吸光度值的比較

2.2各組細(xì)胞Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平的比較

見(jiàn)表2。含銀浸提液組細(xì)胞Bcl-2、Bax和Bcl-2/Bax蛋白表達(dá)水平與對(duì)照浸提液組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但2組各指標(biāo)均高于陰性對(duì)照組。

表2 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax的比較

*:與陰性對(duì)照組比較，P<0.05。

3 討論

細(xì)胞毒性試驗(yàn)是通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)測(cè)定生物材料或其浸提液對(duì)細(xì)胞的毒性作用,包括溶解(細(xì)胞死亡)、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)和其他毒性等。它在評(píng)價(jià)材料生物相容性方面的地位已得到證實(shí)[2]。細(xì)胞毒性試驗(yàn)作為一種初級(jí)快速的毒性篩選和生物安全性評(píng)價(jià)方法，在口腔科領(lǐng)域具有十分重要的地位[3]。

張敏等[4]對(duì)涂銀羥基磷灰石種植體的細(xì)胞毒性進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)其具有良好的生物活性。朱輝等[5]證實(shí)載銀羥基磷灰石人工骨具有良好的生物相容性及安全性。Ando等[6]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)含銀磷酸鈣涂層具有高抗菌活性、低毒性，并且能抑制細(xì)菌黏附的優(yōu)良特性。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度含銀抗菌涂層的鈷鉻合金試件浸提液對(duì)L929細(xì)胞的毒級(jí)均為0～1級(jí)，有極輕微細(xì)胞毒性，與鈷鉻合金試件浸提液及陰性對(duì)照的毒性相當(dāng)。

生物材料誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑主要包括膜死亡受體信號(hào)途徑、線(xiàn)粒體途徑和其他參與凋亡信號(hào)調(diào)控的傳導(dǎo)系統(tǒng)[7]。其中，Bcl-2和Bax在線(xiàn)粒體途徑中起著非常重要的調(diào)控作用。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最具代表性的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡因子[8-9]。Bcl-2蛋白能夠阻遏細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞的壽命，參與調(diào)控細(xì)胞增殖與凋亡的動(dòng)態(tài)平衡，同細(xì)胞分化、成熟、組織器官的發(fā)育及腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切。研究[10]發(fā)現(xiàn)，烤瓷合金在齦溝液內(nèi)腐蝕析出的金屬離子及其衍生物可引起機(jī)體組織的毒性反應(yīng)，并可引起細(xì)胞凋亡。Bax與Bcl-2形成異二聚體復(fù)合物，可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其比值對(duì)細(xì)胞是否發(fā)生凋亡起決定性作用。 Bcl-2/Bax比值越高，細(xì)胞的生存率越高；比值越低，細(xì)胞的生存率越低[11]。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，用含銀抗菌涂層鈷鉻合金試件浸提液處理后，L929細(xì)胞Bcl-2/Bax比值與對(duì)照試件浸提液接近，提示鈷鉻合金含銀抗菌涂層對(duì)細(xì)胞凋亡的作用與鈷鉻合金接近。

總之，作者應(yīng)用MTT法在細(xì)胞水平上評(píng)價(jià)了鈷鉻合金含銀抗菌涂層的細(xì)胞毒性，應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法從分子水平上觀(guān)察了鈷鉻合金含銀抗菌涂層對(duì)細(xì)胞Bcl-2和Bax表達(dá)的影響，從分子水平上證實(shí)了該涂層的生物毒性較小，生物相容性較好。但對(duì)這種涂層材料生物相容性的全面評(píng)價(jià)仍需結(jié)合其他實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更深入的研究與探討。

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